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Type: Tese
Title: Produtos naturais marinhos indutores de morte celular imunogênica em melanoma
Title in English: Natural marine products that induce immunogenic cell death in melanoma
Authors: Brito, Thaís Lima de
Advisor: Wilke, Diego Veras
Co-advisor: Jimenez, Paula Christine
Keywords in Brazilian Portuguese : Microrganismos aquáticos;Melanoma;Bioprospecção
Keywords in English : Aquatic Microorganisms;Melanoma;Bioprospecting
Issue Date: 2023
Citation: BRITO, Thaís Lima de. Produtos naturais marinhos indutores de morte celular imunogênica em melanoma. 2023. 106 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2023. Disponível em: http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/74378. Acesso em: 18 set. 2023.
Abstract in Brazilian Portuguese: O câncer de pele do tipo melanoma metastático se destaca, pois apesar de sua baixa incidência, possui uma alta letalidade. Apesar dos avanços obtidos com as terapias alvo-dirigidas e com os imunoterápicos, a taxa de sobrevida média em cinco anos é de apenas 35%. Tendo em vista que a maioria dos pacientes segue com um prognóstico desfavorável, a busca por novos fármacos ou novas estratégias terapêuticas é necessária. Alguns quimioterápicos citotóxicos clássicos como a doxorrubicina e o paclitaxel induzem morte celular imunogênica (MCI). Células tumorais em processo de MCI liberam sinais associados a danos (DAMPs), os quais ativam resposta imune antitumoral. Desta forma, os indutores de MCI produzem respostas mais eficazes e duradouras devido a eliminação de células tumorais diretamente pela citotoxicidade e pelo sistema imune. Desta forma a prospecção de compostos candidatos a quimioterápicos indutores de MCI é uma estratégia que visa aumentar a expectativa de translação no processo de desenvolvimento de medicamentos. Os produtos naturais marinhos são uma fonte muito promissora de moléculas com potencial anticâncer. Tartrolon D/E (TRL) e cromomicina A5 (CA5) são produtos naturais marinhos citotóxicos sintetizados por bactérias dos gêneros Terednibacter sp. e Streptomyces sp., respectivamente. O presente trabalho teve como objetivo estudar o potencial anticâncer do TRL e da CA5 em melanoma através da indução de morte celular imunogênica. No capítulo 1 foram descritos os estudos realizados com o objetivo de avaliar a indução de MCI por TRL em células de melanoma metastático humano. Inicialmente, foi realizado o ensaio da sulforrodamina B (SRB) para avaliar o efeito do composto sobre a proliferação celular. Em seguida, foram avaliados a indução de estresse, autofagia e morte celular, bem como a liberação de DAMPs, e a expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo e imunoblot. Ademais, os prováveis alvos do tartrolon D foram previstos utilizando a estratégia de target fishing. TRL mostrou atividade antiproliferativa em um painel de 8 linhagens de células tumorais (HCT 116, B16-F10, WM293A, SK-MEL-28, PC-3M, MCF-7 e L929) e em uma linhagem não tumoral (HEK293A), com valores de concentração inibitória média de 0,04 ug/mL a 13 ug/mL após 48h de incubação. Os estudos que se seguiram foram realizados com as linhagens de melanoma B16-F10, WM293A e SK- MEL-28. O TRL induziu morte celular regulada, estresse de retículo, e autofagia nas células avaliadas. Ademais, o TRL também induziu a liberação de DAMPs típicos de MCI, a saber, liberação de HMGB1 nuclear, e a externalização de ERp57, calreticulina e HSP70 na membrana plasmática. Adicionalmente, houve aumento da expressão dos marcadores de superfície MHC II e CD1d nas células B16-F10 incubadas com o TRL. Esse fenótipo complexo de estresse e morte celular associado à liberação de DAMPs em células expostas ao TRL é típico de MCI. O capítulo 2 teve como objetivo avaliar o potencial translacional da CA5, previamente identificada como indutor genuíno de MCI, através da avaliação do efeito antitumoral e da toxicidade em modelo de melanoma murino. Ensaios in vivo (C57BL/6 fêmeas, CEUA No 7270010621) para identificar dose tolerada demonstraram que 1 mg/kg de CA5 induz dor e desconforto intensos nos animais. Adicionalmente, camundongos transplantados com células B16-F10 foram tratados com três estratégias quimioterápicas distintas: metronômica, dose máxima tolerada e dose média intermitente. Animais tratados com 0,3 mg/kg de CA5 3 vezes a cada 72 h (abordagem de dose média intermitente) exibiram uma redução de 60% do volume tumoral. Todavia, esses animais apresentaram sinais de dor, de desconforto, lesões na região do peritônio, além de outras alterações na cavidade peritoneal indicativas de efeitos tóxicos. O grupo CA5 também apresentou leucopenia, relacionada sobretudo à redução de linfócitos. No entanto, não houve alterações nos parâmetros bioquímicos avaliados como ALT, creatinina e ureia. Assim conclui-se que os compostos TRL e CA5 provocam alterações típicas de MCI e são promissores candidatos a quimioterápicos para o tratamento de melanoma metastático e, portanto, merecem mais estudos de desenvolvimento pré-clínico.
Abstract: Melanoma metastatic is a low-incidence tumor, although with high lethality. Despite the advances obtained with target therapy and immunotherapy, the five-year survival rate is only 35%. Considering that most patients have an unfavorable prognosis, the search for new drugs or new therapeutic strategies is necessary. Some classic cytotoxic chemotherapeutic agents such as doxorubicin and paclitaxel induce immunogenic cell death (ICD). Tumor cells undergoing MCI release damage-associated signals (DAMPs), which activate an antitumor immune response. In this way, MCI inducers produce more effective and lasting responses due to the elimination of tumor cells directly by cytotoxicity and the immune system. Thus, prospecting candidate compounds for chemotherapeutic drugs that induce ICD is a strategy that aims to increase the expectation of translation in the drug development process. Marine natural products are a very promising source of cytotoxic compounds. Tartrolon D/E (TRL) and chromomycin A5 (CA5) molecules are marine natural products synthesized by microorganisms of the genus Terednibacter sp. and Streptomyces sp., respectively. The present work aimed to study the antitumor potential of TRL and CA5 in human melanoma, as well as the antitumor effect in murine melanoma and the toxicity of CA5. Chapter 1 describes the studies carried out with the aim of evaluating the induction of ICD by TRL in human metastatic melanoma cells. Initially, the sulforhodamine B (SRB) assay was performed to evaluate the effect of the compound on cell proliferation. Then, the induction of stress, autophagy and cell death, as well as the release of DAMPs, and the expression of surface markers by flow cytometry and immunoblot were evaluated. Furthermore, the probable targets of tartrolon D were predicted using the target fishing strategy. TRL showed antiproliferative activity in 7 tumor cell lines (HCT 116, B16-F10, WM293A, SK-MEL-28, PC-3M and MCF-7) and two non-tumor cell lines (HEK293A and L929), with inhibitory concentration value average of 0.04 uM to 13 uM after 48 hours of incubation. The following studies were performed with B16-F10, WM293A and SK-MEL-28 melanoma cell lines. TRL induced regulated cell death, reticulum stress, and autophagy in the evaluated cells. Furthermore, TRL also induced the release of DAMPs typical of MCI, namely nuclear HMGB1 release, and the externalization of ERp57, calreticulin and HSP70 in the plasmatic membrane. Additionally, there was an increase in the expression of surface markers MHC II and CD1d in B16-F10 cells incubated with TRL. This complex phenotype of stress and cell death associated with the release of DAMPs in cells exposed to TRL is typical of ICD. Chapter 2 aimed to evaluate the translational potential of CA5, previously identified as a genuine inducer of MCI, through the evaluation of its antitumor effect and toxicity in a murine melanoma model. In vivo assays (C57BL/6 females, CEUA No 7270010621) to identify tolerated dose demonstrated that 1 mg/kg of CA5 induces severe pain and discomfort in animals. Additionally, mice transplanted with B16-F10 cells were treated with three different chemotherapy strategies: metronomic, maximum tolerated dose and intermittent average dose. Animals treated with 0.3 mg/kg CA5 3 times every 72 h (intermittent medium dose approach) exhibited a 60% reduction in tumor volume. However, these animals showed signs of pain, discomfort, lesions in the peritoneum region, in addition to other alterations in the peritoneal cavity indicative of toxic effects. The CA5 group also had leukopenia, mainly related to the reduction of lymphocytes. However, there were no alterations in the biochemical parameters evaluated, such as ALT, creatinine and urea. Thus, it is concluded that the TRL and CA5 compounds cause changes typical of ICD and are promising candidates for chemotherapy for the treatment of metastatic melanoma and, therefore, deserve further studies of preclinical development.
URI: http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/74378
Author's Lattes: http://lattes.cnpq.br/1261745955581353
Advisor's Lattes: http://lattes.cnpq.br/5313374711687727
Co-advisor's Lattes: http://lattes.cnpq.br/4248251483705135
Access Rights: Acesso Aberto
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