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Tipo: Tese
Título: Estudo das interações enzima-suporte envolvidas na inativação de lipases imobilizadas em suportes octil-vinilsulfona
Título em inglês: Study of enzyme-support interactions involved in the inactivation of lipases immobilized on octyl-vinylsulfone supports
Autor(es): Souza, Priscila Maria Paiva
Orientador: Rodrigues, Sueli
Palavras-chave: Ativação interfacial de lipases;Inativação de enzimas;Interação;Enzima-suporte
Data do documento: 2022
Citação: SOUZA, Priscila maria Paiva. Estudo das interações enzima-suporte envolvidas na inativação de lipases imobilizadas em suportes octil-vinilsulfona. 2022. 103 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2022.
Resumo: Nesse estudo, a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) e lipase B de Candida antarctica (CALB) foram covalentemente imobilizadas no suporte heterofuncional octil-agarose ativado com divinilsulfona. Os biocatalisadores foram bloqueados usando hexilamina (HA), etilenodiamina (EDA), glicina (GLI) e ácido aspártico (ASP) e tiveram a atividade, estabilidade, especificidade e interações estruturais analisadas. Ambas enzimas mostraram diferenças na estabilidade dos biocatalisadores após a inativação em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5 e 70 °C (TLL) e 80 °C (CALB), tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7 e 70 °C (TLL) e 75 °C (CALB) e tampão carbonato de sódio 50 mM pH 9 e 65 °C (TLL) e 60 °C (CALB), além de variações na especificidade utilizando substratos estruturalmente diferentes como o pNPB, triacetina e (R)- e (S)- metil mandelato. Para os biocatalisadores compostos pela enzima TLL, o bloqueio com glicina apresentou a maior estabilidade em todas as condições de pH avaliadas. Analisando a atividade dos biocatalisadores de TLL contra os diferentes substratos, a triacetina foi o substrato que apresentou uma perda de atividade mais rápida entre todos os bloqueios e pH testados. Para os biocatalisadores compostos pela enzima CALB, o bloqueio com glicina se mostrou o mais estável em pH 5 e 7, enquanto a pH 9 as diferenças entre as estabilidades dos bloqueios foram reduzidas, e o bloqueio com EDA seguido de glicina foram os mais estáveis. Considerando a especificidade aos substratos pelos biocatalisadores de CALB, o pNPB foi o substrato que manteve maiores atividades em todos os bloqueios e porcentagens de inativação. Pode-se concluir que tais diferenças encontradas foram moduladas pelo protocolo de imobilização com diferentes bloqueios e pelas condições de inativação, sendo confirmadas por estudos de fluorescência. Entre os biocatalisadores de TLL, a fluorescência mostrou que, durante o curso de inativação, as distorções estruturais de TLL bloqueada com HA foram mais drásticas (valores Imax baixos e λmax desviados para o vermelho) do que com os demais biocatalisadores. Para os biocatalisadores de CALB, a análise do espectro de fluorescência novamente revelou alterações estruturais no bloqueio com HA, o que pode justificar a menor atividade deste biocatalisador usando pNPB. A análise funcional e estrutural das enzimas imobilizadas e parcialmente inativadas mostraram que a via de inativação é dependente das características do suporte e condições de inativação.
Abstract: In this study, lipases from Thermomyces lanuginosus (TLL) and lipase B from Candida antarctica (CALB) were covalently immobilized on the heterofunctional support octyl-agarose activated with divinyl sulfone. The biocatalysts were blocked using hexylamine (HA), ethylenediamine (EDA), glycine (GLI), and aspartic acid (ASP) and had their activity, stability, specificity and structural interactions analyzed. Both enzymes showed differences in the stability after inactivation in 50 mM sodium acetate buffer pH 5 and 70 °C (TLL) and 80 °C (CALB), 50 mM sodium phosphate buffer pH 7 and 70 °C (TLL) and 75 °C (CALB) and 50 mM sodium carbonate buffer pH 9 and 65 °C (TLL) and 60 °C (CALB), in addition to showing variations in specificity using substrates with distinct structures such as pNPB, triacetin and (R)- and (S)-methyl mandelate. For the TLL biocatalysts, blocking with glycine showed the highest stability under all pH conditions. Analyzing the activity of TLL biocatalysts against different substrates, triacetin was the substrate that showed the fastest loss activity among all the blocked agents and pH tested. For CALB biocatalysts, the one blocked with glycine was the most stable at pH 5 and 7, while at pH 9, the stabilities differences between the blocked biocatalysts were reduced, and blocking with EDA followed by glycine was the most stable. Considering the substrate specificity of CALB biocatalysts, pNPB was the substrate that maintained the highest activities in all blocked preparations and inactivation percentages. It can be concluded that such differences were modulated by the immobilization protocol with different blocks and by the inactivation conditions and were confirmed by fluorescence studies. Among the TLL biocatalysts, fluorescence showed that, during the inactivation course, the structural distortions of HA-blocked TLL were more drastic (low Imax and redshifted λmax values) than with the other biocatalysts. For the CALB biocatalysts, the fluorescence spectrum analysis again revealed structural changes in the blocking with HA, which may explain the lower activity of this biocatalyst using pNPB. The functional and structural analysis of the immobilized and partially inactivated enzymes showed that the inactivation pathway depends on the support characteristics and inactivation conditions.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/72818
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