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Tipo: Tese
Título : Encapsulação de R-ficoeritrina em nanopartícula polimérica de policaprolactona para estabilização e aplicação biológica como biomarcador em células cancerígenas
Título en inglés: Encapsulation of R-phycoerythrin in polycaprolactone polymer nanoparticle for stabilization and biological application as a biomarker in cancer cells
Autor : Martins, Jéssica Roberta Pereira
Tutor: Silva Júnior, Ivanildo José da
Co-asesor: Eloy, Raquel Petrilli
Palabras clave : Nanocápsula;Policaprolactona;R-ficoeritrina;Biomarcador
Fecha de publicación : 2022
Citación : MARTINS, Jéssica Roberta Pereira, Encapsulação de R-ficoeritrina em nanopartícula polimérica de policaprolactona para estabilização e aplicação biológica como biomarcador em células cancerígenas. 2022. 101 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2022.
Resumen en portugués brasileño: A R-ficoeritrina (R-FE) é uma proteína solúvel pertencente a classe das ficobiliproteina, uma proteína fluorescente multimérica (240kDa) cuja fluorescência ocorre pela presença de subunidades semelhantes a discos contendo até 10 cromóforos. A instabilidade do R-FE é um dos fatores que dificultam sua aplicação, sendo necessária a utilização de técnicas que aumentem sua estabilidade. Essa proteína pode ser extraída de espécies de algas vermelhas da família das rodofitas. A Solieria filiformis é uma espécie de macroalga vermelha encontrada no litoral brasileiro. Neste estudo relatamos a extração e purificação de R-FE de Solieria filiformis bem como sua encapsulação em nanopartículas (NP) de policaprolactona (PCL) (nanopartículas de R-FE / PCL) e sua aplicação in vitro. A R-FE foi obtida da alga Solieria filiformis (SISGEN A41C95F) coletadas na praia de Flecheiras-CE. No processo de extração foi utilizada ruptura mecânica, seguido de precipitação das proteínas com sulfato de amônio 90%, dialisada e purificada por cromatografia de troca iônica utilizando uma resina aniônica, resultando em um índice de pureza (IP) de 4,3 e rendimento de 2,57 mg / g de alga úmida. Pretendendo aumentar a estabilidade da R-FE e possibilitar a aplicação da sua florescência foram preparadas formulações de nanopartículas poliméricas pelo método de dupla emulsificação evaporação de solvente usando policaprolactona. Nanopartículas contendo 60 mg de PCL, 2mL de poli(álcool polivinílico) (PVA) 1% e 2 mg R-FE apresentaram tamanho de partícula nanométrico com baixa polidispersidade e eficiência de encapsulação equivalente a 50,0 ± 7,3%. As análises de espectroscopia de infravermelho com transformada de fourier FITR não revelaram nenhuma diferença espectral entre NP e R-FE / PCL, indicando que R-FE está molecularmente dispersa na matriz polimérica. A calorimetria exploratória diferencial (DSC) mostra que R-FE tem dois picos, um a 76,34 ° C e um segundo a 327 ° C. Para nanopartículas de R-FE / PCL, o pico alargado e deslocado a 307 ° C indica a presença da proteína na nanopartícula. A composição estrutural da R-FE e da R-FE/PCL foram analisadas por espectro de dicroísmo circular (DC) sendo possível identificar a presença de folha beta e alfa hélice. A caracterização por microscopia eletrônica de varredura mostrou nanopartículas homogêneas, sem alteração na morfologia das partículas após o carregamento de R-FE e indicou tamanhos de partículas de acordo com os resultados de espalhamento dinâmico de luz. Além disso, in vitro, foi demonstrada a degradação para R-FE não encapsulada, comprovando o aumento da estabilidade da proteína uma vez encapsulada. Finalmente, estudos de microscopia confocal e citometria de fluxo in vitro demonstraram o potencial de nanopartículas de R-FE / PCL para marcação fluorescente em células de câncer de próstata PC-3 e câncer de mama 4T1, com intensidade de fluorescência aumentando ao longo do tempo até 6h. Esses resultados apoiam o potencial das nanopartículas de R-FE / PCL como uma ferramenta inovadora para aplicação biológica na detecção do câncer.
Abstract: R-phycoerythrin (R-PE) is a soluble protein belonging to the phycobiliprotein class, a multimeric fluorescent protein (240kDa) whose fluorescence occurs by the presence of disc-like subunits containing up to 10 chromophores. The instability of the R-PE is one of the factors that make its application difficult, requiring the use of techniques that increase its stability. This protein can be extracted from red algae species of the rhodophyte family. Solieria filiformis is a species of red macroalgae found along the Brazilian coast. In this study we report the extraction and purification of R-PE from Solieria filiformis as well as its encapsulation in polycaprolactone (PCL) nanoparticles (NP) (R-PE / PCL nanoparticles) and its in vitro application. The R-PE was obtained from the algae Solieria filiformis (SISGEN A41C95F) collected on the beach of Flecheiras-CE. In the extraction process, mechanical rupture was used, followed by precipitation of the proteins with 90% ammonium sulfate, dialyzed and purified by ion exchange chromatography using an anionic resin, resulting in a purity index (PI) of 4.3 and a yield of 2.57 mg/g of wet seaweed. Intending to increase the stability of R-PE and enable the application of its flowering, formulations of polymeric nanoparticles were prepared by the double emulsification method and solvent evaporation using polycaprolactone. Nanoparticles containing 60 mg of PCL, 2mL of poly(polyvinyl alcohol) (PVA) 1% and 2 mg R-PE presented nanometric particle size with low polydispersity and encapsulation efficiency equivalent to 50.0 ± 7.3%. Fourier transform FITR infrared spectroscopy analyzes did not reveal any spectral difference between NP and R-PE / PCL, indicating that R-PE is molecularly dispersed in the polymer matrix. Differential scanning calorimetry (DSC) shows that R-PE has two peaks, one at 76.34°C and a second at 327°C. For R-PE/PCL nanoparticles, the widened and shifted peak at 307°C indicates the presence of the protein in the nanoparticle. The structural composition of R-PE and R-PE/PCL were analyzed by circular dichroism (DC) spectrum and it was possible to identify the presence of beta sheet and alpha helix. Characterization by scanning electron microscopy showed homogeneous nanoparticles, with no change in particle morphology after R-PE loading and indicated particle sizes according to dynamic light scattering results. Furthermore, in vitro, degradation to nonencapsulated R-PE was demonstrated, proving the increased stability of the protein once encapsulated. Finally, confocal microscopy and in vitro flow cytometry studies demonstrated the potential of R-PE/PCL nanoparticles for fluorescent labeling in PC-3 prostate cancer and 4T1 breast cancer cells, with fluorescence intensity increasing over time. until 6 am. These results support the potential of R-PE/PCL nanoparticles as an innovative tool for biological application in cancer detection.
URI : http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/70267
Aparece en las colecciones: RENORBIO - Teses defendidas na UFC

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