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Type: TCC
Title: Prospecção de microrganismos isolados de ninho de espuma de Leptodactylus vastus e Physalaemus cuvieri com potencial biotecnológico.
Title in English: Prospecting of microorganisms from foam nest of Leptodactylus vastus and Physalaemus cuvieri with biotechnological potential.
Authors: Castro, Luzia Gabrielle Zeferino de
Advisor: Hissa, Denise Cavalcante
Co-advisor: Oliveira, Francisca Andréa da Silva
Keywords: Anfíbios;Biomoléculas;Gene 16S;Microbiota
Issue Date: 2019
Citation: CASTRO, Luzia Gabrielle Zeferino de. Prospecção de microrganismos isolados de ninho de espuma de Leptodactylus vastus e Physalaemus cuvieri com potencial biotecnológico. 2019. oof. TCC (Graduação em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2019.
Abstract in Brazilian Portuguese: Os ninhos de espuma são um dos modos de reprodução da classe dos anfíbios usados como estratégia para aumentar a possibilidade de fertilização dos ovos. Essas bioespumas atuam na proteção dos ovos e girinos, além de fornecer oxigênio; sendo sua estrutura e composição bioquímica essenciais para sua função. Os ninhos de espumas possuem como componentes principais proteínas surfactantes e carboidratos, além de possuir uma comunidade microbiana. Até o momento, não existem estudos sobre a microbiota associada aos ninhos de espuma e o seu papel no desenvolvimento dos girinos. O objetivo do atual estudo foi conhecer a microbiota cultivável dos ninhos de espuma de Leptodactylus vastus e Physalaemus cuvieri e prospectar enzimas com potencial biotecnológico. Para tanto, as bioespumas foram coletadas na Reserva Particular do Patrimônio Natural de Monte Alegre, na serra de Pacatuba/CE. Após a retirada dos resíduos sólidos presentes nos ninhos de espuma, as amostras foram diluídas seriadamente e plaqueadas usando a técnica de spread plate. Para fins comparativos, as amostras de água da poça de P. cuvieri e do solo da poça de L. vastus também foram plaqueadas. Após contagem de viáveis totais, os morfotipos encontrados nas placas da bioespuma foram isolados e armazenados em estoque glicerol 20% (v/v) nos freezers -80 °C. Os isolados tiveram seu DNA extraído por termólise e CTAB 2X, seguido da amplificação do gene rRNA 16S por PCR e sequenciamento pelo método de Sanger. Para os testes enzimáticos, os isolados foram cultivados em placas de ATGE suplementadas com tributirina (0,1% v/v), amido (0,1% p/v), gelatina (3% p/v) e leite desnatado (1% p/v), para verificar as atividades lipásicas, amilásicas e proteásicas, respectivamente. As colônias das placas de ninhos apresentaram uma média de contagem de viáveis de 2,82 x 107 UFC/ mL em P. cuvieri e 2,74 x 107 UFC/ mL em L. vastus, enquanto as culturas crescidas provenientes de amostras do ambiente tiveram 3,33 x 104 UFC/ mL para amostras de água de P. cuvieri e 1,41 x 106 UFC/ mL para amostras do solo da poça de L. vastus, apresentando uma diferença de unidades formadoras máxima de 1000 vezes maior do que as colônias de água e mínima de 10 vezes maior do que as de solo. Foram isolados 153 morfotipos e a identificação molecular mostrou a presença 32 gêneros de bactérias presentes nos dois ninhos, sendo 11 deles comuns nas duas espécies. Nas atividades enzimáticas, dos isolados de P. cuvieri 23 apresentaram resultados positivos para amilases, 66 para proteases e 56 para lipídios. Já os isolados de L. vastus, 14 apresentaram atividades amilásicas, 45 proteásicas e 41 para lipídios. Nossos resultados fornecem informações inéditas acerca da microbiota cultivável dos ninhos de espuma de P. cuvieri e L. vastus, demonstrando o seu potencial para descoberta de novas biomoléculas com potencial biotecnológico.
Abstract: Foam nests are one of the many reproductive mode found in amphibians, constituting a strategy to increase egg fertilization. They are known to protect eggs and tadpoles against UV radiation, predators and to provide oxygen supply. For these functions, its biochemical composition and structure are essential. Frog foam nests have as major components surfactant proteins and carbohydrates, besides a microbial community. So far, there are no studies concerning the associated microbiota in foam nests and their role in tadpole development nor they biotechnological potential. Hence, this study aimed to identify the cultivable foam nests bacterial community of Leptodactylus vastus and Physalaemus cuvieri and to prospect enzyme-producing microorganisms of biotechnological interest. Frog foams nests were collected at the na Reserva Particular do Patrimônio Natural de Monte Alegre, in Pacatuba/CE. Samples were serially diluted and plated using the spread plate technique. For comparative purposes, water and soil samples where the nests of were placed were also plated. After total viable counting, the morphotypes found in the foam nests plates were isolated and stored in glycerol 20% (v/v) stock in freezers at -80° C. The isolates had their DNA extracted by thermolysis and CTAB 2X, followed by the 16S rRNA gene amplification and sequencing by the Sanger method. For enzymatic tests, isolates were grown in ATGE plates supplemented with tributyrin (0.1% v/v), starch (0.1% w/v), gelatin (3% w/v) and skim milk (1 % w/v), to verify lipase, amylase and protease activities, respectively. The nests had a viable count average of 2.82 x 107 CFU/mL for P. cuvieri and 2.74 x 107 CFU/mL for L. vastus, while environmental samples had 3.33 x 104 CFU/mL in water where the foam nest of P. cuvieri was disposed and 1.41 x 106 CFU/mL for the soil where the foam nest of L. vastus was disposed. Compared with the water and soil samples, the foam nests presented approximately 1000 times greater than those of the water and 10 times larger than the soil. A total of 153 morphotypes were isolated and molecular identification showed the presence of 32 genera of bacteria, in which 11 were common for both species. In the enzymatic activities, 23 isolates of P. cuvieri showed positive results for amylase, 66 for proteases and 56 for lipases. On the other hand, L. vastus showed 14 amylase, 45 proteases, and 41 lipases. Our results show that foam nests provide a selection environment for microorganisms with biotechnological potential for the discovery of novel biomolecules.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/48589
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