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http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/48582| Type: | TCC |
| Title: | Expressão heteróloga e avaliação da capacidade de ligação da região variável do anticorpo monoclonal Ofatumumabe |
| Title in English: | Heterologous expression and binding capacity assessment of the variable region of monoclonal antibody Ofatumumab. |
| Authors: | Studart, Igor Cabral |
| Advisor: | Alves, Murilo Siqueira |
| Co-advisor: | Furtado, Gilvan Pessoa Gambim, Marcela Helena |
| Keywords: | Ofatumumabe;Expressão heteróloga;CD20;Fragmentos de anticorpos |
| Issue Date: | 2019 |
| Citation: | STUDART, Igor Cabral. Expressão heteróloga e avaliação da capacidade de ligação da região variável do anticorpo monoclonal Ofatumumabe. 2019. 71 f. TCC (Graduação em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2019. |
| Abstract in Brazilian Portuguese: | Ofatumumabe é um anticorpo monoclonal humano anti-CD20 utilizado no tratamento de doenças em que a depleção de células B é uma estratégia relevante, como Leucemia Linfoide Crônica, Linfomas não-Hodgkin e Esclerose Múltipla. O fragmento variável de cadeia única (scFv) é uma construção em que os domínios variáveis das cadeias leve e pesada de um anticorpo são unidos por um linker. Algumas vantagens estão associadas ao formato de scFvs, principalmente devido ao seu tamanho reduzido, quando comparados aos anticorpos completos, e à possibilidade de serem expressos em sistema procarioto. O presente estudo visou expressar, purificar e avaliar a capacidade de ligação do scFv do Ofatumumabe. Pretende-se, em estudos futuros, aplicar este scFv como referencial em ensaios biológicos associados tanto à determinação dos resíduos cruciais do Ofatumumabe envolvidos em sua capacidade de ligação à molécula CD20 (parátopo), bem como no contexto da busca pela geração de mutantes com propriedades melhoradas, como anticorpos completos com afinidade superior ou especificidade alterada. Para a expressão heteróloga, foram utilizados o vetor pET-SUMO e a cepa de Escherichia Coli SHuffle. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em coluna contendo níquel. Avaliou-se a purificação por SDS-PAGE, e realizaram-se imunoensaios para a avaliação da capacidade de ligação (Western blot e ELISA). Houve um rendimento médio de 4,3 mg/L de cultura a partir da expressão e purificação da porção solúvel. Pela análise eletroforética e pelo Western blot, obteve-se evidência da expressão do scFv. Os imunoensaios realizados não puderam confirmar a retenção da capacidade de ligação do scFv às células CD20+ aplicadas nestes testes. Conclui-se que a proteína recombinante foi expressa parcialmente solúvel e que estudos futuros de otimização do processo ainda serão necessários para se alcançar maior rendimento na produção do scFv. A busca por estratégias experimentais de avaliação adequada da capacidade de ligação para este scFv permanece como desafio. As restrições associadas ao uso de células que devem manter o antígeno alvo íntegro em suas membranas, de modo que exponham adequadamente a dupla região do epítopo para interação com o fragmento em questão, bem como as possíveis limitações do próprio tipo de fragmento para aplicação nesses testes – além de prováveis alterações estruturais da proteína – podem estar na base da dificuldade de detecção da capacidade de ligação do scFv obtido. |
| Abstract: | Ofatumumab is a human anti-CD20 monoclonal antibody used in the treatment of diseases in which B cell depletion might be beneficial, such as Chronic Lymphoid Leukemia, Non-Hodgkin's Lymphoma and Multiple Sclerosis. The single-chain fragment variable (scFv) is a construct in which the light and heavy chain variable domains of an antibody are joined by a linker. Some advantages are associated with the scFv format, mainly due to its reduced size when compared to whole antibodies and its ability to be expressed in prokaryotic system. The present study aimed to express, purify and assess the binding capacity of the scFv from Ofatumumab. In future studies, it is intended to apply this scFv as a reference in biological assays associated with the determination of crucial Ofatumumab residues involved in its binding capacity to the CD20 molecule, as well as in the context of the production of mutants with improved properties. For expression, pET-SUMO was used as the vector and the Escherichia Coli SHuffle was the strain chosen. Purification was performed by nickel-containing column affinity chromatography. Purification was evaluated by SDS-PAGE, and immunoassays were performed to assess binding capacity (Western blot and ELISA). There was an average yield of 4.3 mg/L of culture from expression and purification of the soluble fraction. By electrophoresis and Western blot, evidence of scFv expression was obtained. The immunoassays performed could not confirm retention of scFv binding capacity to CD20+ cells applied in these assays. It was concluded that the recombinant protein was expressed partially soluble. Future studies of process optimization will still be necessary to achieve higher yield in scFv production. The search for experimental strategies to properly assess scFv binding capacity remains a challenge. The restrictions associated with the use of cells that must keep the target antigen available on their membranes so that they adequately expose the double epitope region for interaction of the analyzed fragment throughout the assay, as well as the possible limitations of the fragment type itself for application in these tests – in addition to probable structural changes in scFv – may underlie the difficulty of detecting the binding capacity of the scFv obtained. |
| URI: | http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/48582 |
| Appears in Collections: | BIOTECONOLOGIA - Monografias |
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