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http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/29680| Tipo: | Dissertação |
| Título : | Caracterização biofísica da Frutalina recombinante e sua aplicação na purificação de Imunoglobulinas a1 (siga1) secretoras humanas |
| Título en inglés: | Biophysical characterization of recombinant frutalin and its application in the purification of human secretory immunoglobulin A1 (SIgA1) |
| Autor : | Leite, Talita Abrante |
| Tutor: | Rocha, Bruno Anderson Matias da |
| Co-asesor: | Silva, André Luis Coelho da |
| Palabras clave : | Frutalina recombinante;Imobilização de lectina;SIgA1;Artocarpus incisa |
| Fecha de publicación : | 2016 |
| Citación : | LEITE, T. A. (2016) |
| Resumen en portugués brasileño: | A frutalina é uma multilectina capaz de se ligar a -D-galactose e -D-manose, presente em sementes de fruta-pão de caroço (Artocarpus incisa L.). Ela pertence a família das “lectinas relacionadas a jacalina” e apresenta em torno de 98% de identidade com a jacalina. Em decorrência da alta identidade estrutural entre a jacalina e a frutalina e a utilização da jacalina na purificação de IgA1, estudos recentes mostram a utilização da frutalina imobilizada para a purificação de IgA1 humano o que a torna uma alternativa de baixo custo á matriz comercial ImmobilizedJacalin®. Um dos problemas inerentes a utilização da frutalina imobilizada como alternativa na purificação de IgA1 humano é a quantidade de material biológico necessário para a construção das matrizes cromatográficas. Uma alternativa é a utilização da proteína produzida heterologamente em microorganismos. Neste trabalho objetivou-se a caracterização biofísica da frutalina recombinante (rFrutalin) e a avaliação da sua utilização como insumo na purificação de IgA1 de colostro humano. A rFrutalina foi expressa em cepas de Pichia pastoris KM71H transformadas e a sua purificação feita em coluna de agarose-D-Galactose (Sigma). Para a caracterização biofísica foram feitas analises de dicroísmo circular (CD) para avaliação da termoestabilidade, influencia da variação de pH e predição das estruturas secundárias, além de análises de fluorimetria intrínseca, espalhamento dinâmico da luz (DLS) e espalhamento de luz eletroforético (ELS ou Potencial Zeta). Para a produção de uma matriz de purificação de IgA1 do colostro humano, foram testadas amostras da rFrutalina (na concentração de 4 mg/mL de matriz) no processo de imobilização na agarose ativada. Em seguida, essas amostras foram adicionadas às matrizes ativadas e mantidas sob agitação a 4 oC por 2 minutos. Foram avaliados diferentes tempos de imobilização (2, 6 e 12 horas). Os resultados de CD da rFrutalina apresentaram um perfil similar ao da frutalina nativa, mostrando predominância de estruturas do tipo folhas-. A rFrutalina apresenta conformação estável em condições ácidas e em temperaturas de até 60°C. O método de espalhamento dinâmico de luz (DLS) confirmou que a oligomerização da rFrutalina não muda com a variação de pH e que sua massa corresponde, aproximadamente, a 59 ± 4 kDa. As matrizes agarose-rFrutalina produzidas foram capazes de reter uma fração rica em IgA1 (FrIgA1). Todas as9 matrizes testadas apresentaram dois picos cromatográficos: um pico referente as proteínas que não interagiram com a matriz e outro pico, referente a FrIgA1 que interagiu com a matriz e foi eluída com D-galactose. Com base nesse resultado, ficou evidente que o tempo de imobilização da rFrutalina na matriz, influenciou proporcionalmente na sua capacidade de retenção do ligante, já que a matriz submetida a imobilização por 12 h apresentou um melhor desempenho cromatográfico. Do ponto de vista biofísico, a rFrutalina expressa em P. pastoris, não apresentou nenhuma mudança significativa, quando relacionada as caracteristicas biofísicas da frutalina nativa, o que corrobora a utilização da rFrutalina na purificação de IgA1 de colostro humano, como uma alternativa viável a matriz comercial ImmobilizedJacalin®. |
| Abstract: | Frutalin is a -D-galactose and -D-manose binding multilectin from Artocarpus incisa L. seeds. It belongs to the 'jacalin lectins related' family and presents around 98% identity with jacalina. Due to the high structural identity between jacalin and frutalin and the use of jacalin for IgA1 purification, a recent study showed the use of immobilized frutalin for human IgA1 purification. A low-cost alternative to the commercial ImmobilizedJacalin® collumn. One of the problems inherent in the use of immobilized frutalin as an alternative to human IgA1 purification is the amount of biological material necessary for the construction of chromatographic matrices. An alternative is the use of protein heterologously produced in microorganisms. This work aimed to biophysical characterization of recombinant frutalin (rFrutalin) and evaluation of its use as input in IgA1 purification of human colostrum. Frutalin was expressed in Pichia pastoris KM71H strain transformed and purified in agarose-Dgalactose columns (Sigma). For biophysical characterization circular dichroism (CD) analysis was performed to evaluate the thermal stability, influences of pH variation and prediction of secondary structures, and intrinsic fluorimetric analysis, dynamic light scattering (DLS) and scattering electrophoretic light (ELS or Zeta Potential). For the production of an IgA1 purification matrix of human colostrum, samples were tested in the rFrutalina (at concentration of 4 mg / ml matrix) in the locking process in the activated agarose. Then the samples were added to the activated matrices and maintained under stirring at 4 ° C for 2 minutes. Immobilization was evaluated at different times (2, 6 and 12 hours). The rFrutalina CD results showed a negative band with a maximum amplitude 218 and another positive band with a maximum 222 nm profile, similar to the native frutalin, showing predominantly sheet-β structure. Frutalin is stable, conformationally under acidic conditions at temperatures up to 60 ° C. The dynamic light scattering method (DLS) confirmed that the oligomerization of rFrutalina does not change with pH change and that its mass corresponds to approximately 59 ± 4 kDa. The agarose-frutalin matrices produced were able to retain a rich fraction IgA1 (FrIgA1). All tested matrices showed two chromatographic peaks: a peak related to proteins which did not interact with the matrix and another peak related to FrIgA1 that interacted with the matrix and was eluted with Dgalactose. Based on this result, it became clear that the downtime of the rFrutalin matrix influenced proportionally in its binder holding capacity, since the matrixsubjected to immobilization for 12 h showed better chromatographic performance. By the biophysical point of view, rFrutalina expressed in P. pastoris, showed no significant change when related to biophysical characteristics of the native frutalin, which supports the use of rFrutalina in IgA1 purification of human colostrum, as a viable alternative to commercial ImmobilizedJacalin® column. |
| Descripción : | LEITE, Talita Abrante. Caracterização biofísica da Frutalina recombinante e sua aplicação na purificação de Imunoglobulinas a1 (siga1) secretoras humanas. 2016. 81 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. |
| URI : | http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/29680 |
| Aparece en las colecciones: | DBBM - Dissertações defendidas na UFC |
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| Fichero | Descripción | Tamaño | Formato | |
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