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Type: Dissertação
Title: Utilização de agente de reticularização em matriz descelularizada (SCAFFOLD) de pele de tilápia (Oreochromis niloticus) para o desenvolvimento de biomaterial com aplicação em medicina regenerativa
Title in English: Use of reticularization agent in decellularized matrix (SCAFFOLD) of tilapia skin (Oreochromis niloticus) for the development of biomaterials with application in regenerative medicine
Authors: Silva, Sofphia Martins da
Advisor: Rodrigues, Felipe Augusto Rocha
Co-advisor: Paier, Carlos Roberto koscky
Keywords: Tilápia;Matriz Extracelular;Matriz Extracelular Descelularizada;Glutaral
Issue Date: 2023
Citation: SILVA, Sofphia Martins da. Utilização de agente de reticularização em matriz descelularizada (SCAFFOLD) de pele de tilápia (Oreochromis niloticus) para o desenvolvimento de biomaterial com aplicação em medicina regenerativa. 2023. 95 f. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Medicina Translacional) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2023. Disponível em: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/74033. Acesso em: 21 ago. 2023.
Abstract in Brazilian Portuguese: Os dispositivos médicos derivados de matriz extracelular (MEC) de origem animal disponíveis no mercado apresentam custo elevado e são pouco acessíveis para a população de baixa renda. Para atender os critérios de um bom material, são necessários testes que garantam resistência e sejam promissores na relação custo/benefício aos pacientes. Reconhecendo o grande valor terapêutico da pele de tilápia e do já desenvolvido scaffold, é preciso otimizar essa matriz e modificar as propriedades estruturais para que adquiram durabilidade, resistência e biocompatibilidade com fins nas aplicações internas e reconstrutivas de medicina regenerativa. Tais propriedades podem ser melhoradas por meio da reticularização, ou seja, adição de ligações cruzadas (crosslinkings) na estrutura proteica da matriz extracelular da pele. Portanto, este trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de produção da matriz proteica descelularizada (scaffold) reticularizada, derivada da pele de tilápia (Oreochromis niloticus). Para tanto, os scaffolds foram produzidos e, em seguida, foram submetidos aos protocolos de modificação da matriz descelularizada pela adição do agente de reticularização química Glutaraldeído (GTA). O desenho experimental consistiu em: 4 protocolos (4 concentrações - 0,05%, 0,25%, 0,625% e 1% e 2 tempos de incubação distintos - 24h e 72h), totalizando 8 grupos testes em comparação com o scaffold sem tratamento e a pele de tilápia in natura. Todas as amostras foram submetidas a análise histológica (Hematoxilina- Eosina - HE e Picrosirius Red), tensiométrica, bioquímica (degradação e hidrólise) e citotóxica seguindo a normativa ISO 10993-5:2009. Os dados quantitativos foram analisados por meio do teste ANOVA (especificar pós testes), com índice de significância de 95%, através do software GraphPad Prism®. Os resultados demonstram que protocolo de reticularização em menor concentração (0,05%) e tempo de incubação (24h) foi o mais promissor para futuros testes in vivo. A adição de ligações cruzadas possibilitou menor nível de biodegradação enzimática (DH), otimizou a organização fibrilar tanto em espessura quanto em quantificação de colágeno total, tipo I e III e a proporção I>III. A característica estrutural do biomaterial (scaffold sem tratamento) foi conservada em todos os protocolos, exceto na maior concentração (1%) independente do tempo de incubação. Após a reticularização, o biomaterial apresentou maior resistência a tração, demonstrando maior grau de rigidez e elasticidade da matriz, corroborando com os achados histológicos. Todos os protocolos testados foram aprovados no teste de citotoxicidade. Todos os protocolos demonstram similaridade com a pele de tilápia in natura em aspectos de resistência mecânica e biocompatibilidade in vitro. Em relação a otimização do tempo, a maior vantagem é a relação custo/benefício no processo de produção do biomaterial; pois, em menores concentrações e em menor tempo de contato do scaffold com o GTA é obtido uma maior resistência física (elasticidade), bioquímica (menor ação de lise enzimática) e biocompatibilidade in vitro. Por fim, a MEC descelularizada e reticularizada demonstrou melhor comportamento biológico e estabilidade do colágeno com capacidade de resistência à ação enzimática biodegradante in vitro em menores concentrações e tempos de contato com o agente GTA. Futuros testes in vivo auxiliarão a compreender a durabilidade a longo prazo desse biomaterial para fins de cirurgias internas e reconstrutivas na medicina regenerativa.
Abstract: Medical devices derived from extracellular matrix (ECM) of animal origin available on the market are expensive and inaccessible to the low-income population. To meet the criteria of a good material, tests are needed that guarantee resistance and are promising in terms of cost/benefit for patients. Recognizing the great therapeutic value of tilapia skin and the already developed scaffold, it is necessary to optimize this matrix and modify the structural properties so that they acquire durability, resistance and biocompatibility for purposes in internal and reconstructive applications of regenerative medicine. Such properties can be improved through reticularization, that is, the addition of crosslinks in the protein structure of the extracellular matrix of the skin. Therefore, this work aimed to develop a protocol for the production of reticular decellularized protein matrix (scaffold) derived from tilapia skin (Oreochromis niloticus). For this purpose, the scaffolds were produced and then submitted to decellularized matrix modification protocols by adding the chemical crosslinking agent Glutaraldehyde (GTA). The experimental design consisted of: 4 protocols (4 concentrations - 0.05%, 0.25%, 0.625% and 1% and 2 different incubation times - 24h and 72h), totaling 8 test groups compared to the scaffold without treatment and fresh tilapia skin. All samples were submitted to histological analysis (Hematoxylin-Eosin - HE and Picrosirius Red), tensiometric, biochemical (degradation and hydrolysis) and cytotoxic analysis following ISO 10993-5:2009. Quantitative data were analyzed using the ANOVA test (specify post tests), with a significance level of 95%, using the GraphPad Prism® software. The results demonstrate that crosslinking protocol at lower concentration (0.05%) and incubation time (24h) was the most promising for future in vivo tests. The addition of cross-links enabled a lower level of enzymatic biodegradation (DH), optimized fibrillar organization both in thickness and in quantification of total collagen, types I and III and the proportion I/>III. The structural characteristic of the biomaterial (scaffold without treatment) was preserved in all protocols, except for the highest concentration (1%) regardless of the incubation time. After reticularization, the biomaterial showed greater resistance to traction, demonstrating a greater degree of rigidity and elasticity of the matrix, corroborating the histological findings. All tested protocols passed the cytotoxicity test. All protocols demonstrate similarity with fresh tilapia skin in terms of mechanical resistance and in vitro biocompatibility. Regarding time optimization, the biggest advantage is the cost/benefit ratio in the biomaterial production process; because, at lower concentrations and shorter contact time between the scaffold and the GTA, greater physical resistance (elasticity), biochemical resistance (less enzymatic lysis action) and in vitro biocompatibility are obtained. Finally, the decellularized and reticularized ECM showed better biological behavior and collagen stability with resistance capacity to the in vitro biodegradable enzymatic action at lower concentrations and contact times with the GTA agent. Future in vivo tests will help to understand the long-term durability of this biomaterial for internal and reconstructive surgeries in regenerative medicine.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/74033
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