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http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/70295| Tipo: | Dissertação |
| Título : | Caracterização de uma monooxigenase lítica de polissacarídeo recombinante de Chromobacterium violaceum que apresenta atividade inibitória contra espécies de Candida |
| Título en inglés: | Characterization of a recombinant lytic polysaccharide monooxygenase from Chromobacterium Violaceum with inhibitory activity against Candida species |
| Autor : | Queiroz, Bruno Roberto da Silva |
| Tutor: | Grangeiro, Thalles Barbosa |
| Palabras clave : | LPMO;Atividade peroxidase-like;Quitina;Atividade anti-Candida |
| Fecha de publicación : | 2022 |
| Citación : | QUEIROZ, Bruno Roberto da Silva. Caracterização de uma monooxigenase lítica de polissacarídeo recombinante de Chromobacterium violaceum que apresenta atividade inibitória contra espécies de Candida. 2022. 99 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2022. |
| Resumen en portugués brasileño: | As LPMOs (mono-oxigenases líticas de polissacarídeos) constituem uma classe de enzimas, denominadas enzimas auxiliares, que são caracterizadas por seu mecanismo de clivagem oxidativa de polissacarídeos recalcitrantes encontrados na natureza, potencializando as atividades de hidrolases de glicosídeos canônicas. Algumas LPMOs foram identificadas no genoma de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, entre elas a LPMO codificada pela ORF CV2592. Uma análise inicial revelou que essa LPMO apresenta uma estrutura modular, contendo os domínios LPMO_10 (domínio com atividade “peroxidase-like”), GbpA_2 (domínio de ligação a N-acetil-glicosamina) e ChiA1_DB (domínio de ligação à quitina). Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar a funcionalidade desta LPMO com relação à atividade “peroxidase-like” e seu potencial de inibição sobre células de espécies de Candida. Análises in silico revelaram que Cv2592 pertence à família AA10 da classe de enzimas de atividades auxiliares. Semelhante às demais LPMOs descritas, Cv2592 apresenta dois resíduos de histidina conservados em seu sítio catalítico, cuja função é coordenar o íon metálico Cu+2 , essencial para a atividade oxidativa da enzima. A LPMO recombinante fusionada à “tag” de solubilidade, proteína SUMO (rCvLPMO- SUMO), foi expressa em E. coli BL21(DE3) e purificada por cromatografia de afinidade à metal imobilizado, exibindo massa molecular aparente de 56 kDa quando analisada por SDS-PAGE. A identidade dessa proteína foi confirmada por espectrometria de massas, que produziu peptídeos com cobertura de 45,3% da sua estrutura primária. A caracterização in vitro mostrou que rCvLPMO-SUMO possui atividade peroxidásica sobre o substrato 2,6-dimetoxifenol, demonstrando a funcionalidade do domínio catalítico LPMO_10. A funcionalidade do domínio de ligação à quitina ChiA1_DB também foi confirmada por meio de cromatografia de afinidade em matriz de quitina. As condições ótimas para a atividade enzimática foram determinadas em pH 7,0 e temperatura de 50 °C. rCvLPMO-SUMO apresentou estabilidade em relação à variação de pH, mantendo pelo menos 80% de sua atividade após ser submetida a valores extremos de pH (3,0 a 10,0) e temperatura de 60 °C. A atividade da rCvLPMO-SUMO foi inibida completamente na presença de 5 mM dos íons Fe+3, Ag+ e Hg+2, SDS 2%, EDTA 5 mM e DTT 100 mM. Análises de dicroísmo circular indicaram uma Tm de 74,9 °C. rCvLPMO-SUMO apresentou atividade inibitória e letal contra várias estirpes de Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis. Análises de microscopia eletrônica de transmissão (MET) evidenciaram danos causados por rCvLPMO-SUMO em células de Candida parapsilosis. Análises de viabilidade celular e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) com iodeto de propídio e DCFH-DA, respectivamente, revelaram que a proteína causa permeabilização da membrana plasmática e induz a produção de ROS pelas células de Candida expostas à rCvLPMO-SUMO. |
| Abstract: | LPMOs (lytic polysaccharide monooxygenases) constitute a class of enzymes, called auxiliary enzymes, which are characterized by their mechanism of oxidative cleavage of polysaccharides, enhancing the activities of canonical glycoside hydrolases, involved in the degradation of recalcitrant polysaccharides found in nature. Some LPMOs were identified in the genome of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, including the LPMO encoded by the ORF CV2592. An initial analysis revealed that this LPMO has a modular structure, containing the LPMO_10 (peroxidase activity), GbpA_2 (N- acetylglucosamine binding domain) and ChiA1_DB (chitin binding domain) domains. Thus, the aim of this work was to analyze the functionality of this LPMO in relation to peroxidase-like activity and its inhibition potential on Candida species. In silico analysis revealed that CV2592 belongs to the AA10 family of auxiliary activity enzymes. All LPMOs have two conserved histidine residues in their catalytic site, forming a histidine arm whose function is to coordinate Cu2+ , which is essential for the oxidative activity of LPMOs. Recombinant LPMO (rCvLPMO-SUMO) fused to the solubility tag SUMO was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) and purified by immobilized metal affinity chromatography, exhibiting an apparent molecular mass of 56 kDa. The identity of this protein was further confirmed by mass spectrometry, which produced peptides covering 45.3% of their primary structure. The in vitro characterization showed that rCvLPMO- SUMO has peroxidase activity on the substrate 2,6-dimethoxyphenol, demonstrating the functionality of the LPMO_10 catalytic domain. The functionality of the chitin binding domain, ChiA1_DB, was also confirmed by chitin matrix affinity chromatography. The optimal conditions for enzymatic activity were determined at pH 7.0 and temperature of 50 oC. rCvLPMO-SUMO was stable in relation to pH variation, maintaining at least 80% of its activity after being subjected to extreme pH values and a temperature of 60 °C. The rCvLPMO-SUMO activity is completely inhibited in the presence of 5 mM Fe3+, Ag+ and Hg2+ ions and 2% SDS, 5 mM EDTA and 100 mM DTT. Circular dichroism experiments indicate a Tm of 74.9 °C. rCvLPMO-SUMO presented inhibitory and lethal activities against several strains of Candida albicans, Candida parapsilosis and Candida tropicalis. Transmission electron microscopy (TEM) analysis evidenced the damage caused by rCvLPMO-SUMO to Candida cells. Cell viability analyzes and ROS production with propidium iodide and DCFH-DA, respectively, revealed that the protein causes permeabilization of the plasma membrane and induces the production of reactive oxygen species by Candida cells treated with rCvLPMO-SUMO. |
| URI : | http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/70295 |
| Aparece en las colecciones: | DBBM - Dissertações defendidas na UFC |
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