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Tipo: Dissertação
Título : Produção e caracterização preliminar de variantes de L-asparaginase II de Escherichia coli de menor potencial imunogênico: combinação de estudos in silico e in vitro
Título en inglés: Production and characterization of mutants of lower immunogenic potential of L-asparaginase II from Escherichia coli: combination of in silico and in vitro studies
Autor : Caetano, Ludmilla Freire
Tutor: Pessoa, Claudia do Ó
Co-asesor: Furtado, Gilvan Pessoa
Palabras clave : Leucemia-Linfoma Linfoblástico de Células Precursoras;Escherichia coli;Simulação de Dinâmica Molecular
Fecha de publicación : 9-ene-2020
Citación : CAETANO, L. F. Produção e caracterização preliminar de variantes de L-asparaginase II de Escherichia coli de menor potencial imunogênico: combinação de estudos in silico e in vitro. 2020. 72 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2020.
Resumen en portugués brasileño: A L-asparaginase tipo II (LASNase II) é uma proteína terapêutica utilizada no tratamento da Leucemia Linfóide Aguda (LLA), promovendo a depleção de asparagina sérica imprescindível na proliferação de células tumorais. Sua principal fonte produtiva é bacteriana, principalmente de Erwinia chrysanthemi e Escherichia coli. Apesar de sua eficiência antileucêmica, reações de hipersensibilidade e pancreatite em pacientes são atribuídas à sua antigenicidade, relativa aos seus epítopos imunogênicos como antígenos às células do sistema imunológico. Ferramentas de Bioinformática para predição de fragmentos imunogênicos e técnicas de Engenharia de Proteínas podem ser usadas na deimunização por alteração de sequências peptídicas específicas, resultando em possíveis proteínas melhoradas quanto às propriedades terapêuticas (biobetters). Baseando-se em um trabalho do grupo de bioinformática estrutural da Fiocruz Ceará, onde métodos de identificação molecular para afinidade dos epítopos antigênicos de LASNase II de E. coli (ECLASNaseII) e a fenda de ligação do MHC II (Complexo Principal de Histocompatibilidade II) foram desenvolvidos, o objetivo deste trabalho combinou tal análise in silico à técnica de mutagênese sítio-dirigida para produzir quatro variantes da ECLASNaseII, expressando-as e purificando-as, além de promover a caracterização bioquímica quanto à cinética enzimática, atividade glutaminásica, efeito de diferentes pH e temperaturas e avaliação do potencial citotóxico da proteína nativa e mutantes. Tal caracterização é o primeiro passo para posterior ensaio de determinação de seu efeito imunogênico. A partir do vetor recombinante ansB-pETSUMO, mutações foram inseridas no gene com auxílio de primers mutagênicos, e as proteínas mutantes e nativa foram expressas em sistema bacteriano E. coli Rosetta. Após a purificação por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) otimizada por digestão com SUMO protease para retirada da His-sumo-tag, a ECLASNaseII nativa foi submetida a ensaios de caracterização bioquímica por reação de Nesslerização, avaliação da catálise frente a diferentes pH (3 a 11) e temperaturas (20 a 90 ˚C), cinética enzimática (Km e Vmáx) e efeito citotóxico por MTT em linhagens tumorais linfóide e mielóde. As mutações selecionadas foram adicionadas com sucesso à sequência do gene ansB, e a EcLASNasII nativa foi expressa em sua forma solúvel e funcional para asparagina e glutamina, e apresentou atividade máxima em pH 8,5 e temperatura de 60 oC. As quatro variantes de ECLASNaseII mutadas não apresentaram atividade asparaginásica no ensaio funcional pelo método de Nessler, e a análise por simulação de dinâmica molecular evidenciou a ocorrência de interações interatômicas entre os resíduos do sítio catalítico e o resíduo de aspartato substituto, presente em todas as variantes, o que pode ter prejudicado suaa interação com o substrato. Tal hipótese parece ser a principal causa da não-funcionalidade das proteínas mutadas, o que será comprovado com a reversão desta mutação e continuade dos ensaios de caracterização bioquímica e funcional.
Abstract: L- asparaginase type II (LASNase II) is a therapeutic protein used in the treatment of Acute Lymphoid Leukemia (ALL), promoting the depletion in serum asparagine which is essential in the proliferation of tumor cells. Its main productive source is bacterial, and common available formulations are from Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli. Despite their anti-leukemic efficiency, hypersensitivity reactions and pancreatitis in patients are attributed to their antigenicity, since there is the activation and processing of their immunogenic epitopes as antigens to the cells of the immune system, and consequent resistance by the production of Anti-asp antibodies. Bioinformatics tools applied to the prediction of immunogenic fragments and Protein Engineering techniques can be used in deimmunization by deleting specific peptide sequences, which enables the development of biobetters. Based on a work of structural bioinformatics group at Fiocruz Ceará, in which molecular identification methods for the affinity of the E. coli LASNase II antigenic epitopes (ECLASNaseII) and the MHC II (Histocompatibility II Complex Complex) binding gap ) were developed, the objective of this work was to combine such in silico analysis with the site-directed mutagenesis technique in order to generate four variants of ECLASNaseII through cloning, heterologous expression, purification by affinity chromatography, and to promote its biochemical characterization regarding kinetics enzymatic, glutaminase activity, effect of different pH and temperatures and evaluation of the cytotoxic potential of native protein and mutants, as a standard step in determining its immunogenic effect. From the ansB-pETSUMO recombinant vector, mutations were inserted into the gene with the aid of mutagenic primers, and the mutant and native proteins were expressed in bacterial system E. coli Rosetta. After purification by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) optimized by the digestion with SUMO protease to remove Histag, the native ECLASNaseII was subjected to biochemical characterization tests by Nesslerization reaction, evaluation of catalysis against different pH (3 to 11) and temperatures (20 to 90 ˚C), enzymatic kinetics (Km and Vmax) and cytotoxic effect by MTT in lymphoid and myeloid tumor lines. The four mutated ECLASNaseII variants did not show any apparent asparaginase activity in the functional assay by the Nessler method. An analysis by simulation of molecular dynamics showed the occurrence of interatomic interactions between the catalytic site residues and the substitute aspartate residue, present in all variants, which may have impaired the interaction with the substrate. This hypothesis seems to be the main cause of the non-functionality of the mutated proteins, which will be proven with the reversal of this mutation and the continuity of the biochemical and functional characterization assays. Keywords: L-asparaginase II, immunogenicity, biobetter.
URI : http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/55993
Aparece en las colecciones: PPGF - Dissertações defendidas na UFC

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