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Tipo: Tese
Título: Clonagem e expressão do gene da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) em Pichia pastoris e Nicotiana tabacum
Autor(es): Carvalho, Cristina Paiva da Silveira
Orientador: Grangeiro, Thalles Barbosa
Coorientador: Oliveira, José Tadeu Abreu de
Palavras-chave: ConBr recombinante;Clonagem;Transformação de plantas;Levedura
Data do documento: 2004
Citação: CARVALHO, Cristina Paiva da Silveira. Clonagem e expressão do gene da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) em Pichia pastoris e Nicotiana tabacum. 2004. 154 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2004.
Resumo: No presente trabalho é feita a descrição da clonagem e expressão do gene da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) em dois sistemas heterólogos: a levedura Pichia pastoris e plantas de fumo (Nicotiana tabacum varo Xanthi). Seis versões do gene conbr codificando para pré-pro-ConBr, pré-ConBr, pro-ConBr, pré-cadeia alfa, fragmento beta e fragmento gama foram clonadas em células de Pichia pastoris GSl15. Os diferentes insertos foram obtidos a partir do desenho de iniciadores com base na seqüência de nucleotídeos do gene conbr depositada no GenBank sob número de acesso Y13904. Cada um dos insertos foi subclonado em dois diferentes vetores de expressão, os plasmídeos pPICZaA e pPICZB. O primeiro permite que a proteína recombinante seja secretada para o meio extracelular, enquanto o segundo permite a expressão intracelular. As células de levedura transformadas com os insertos pro-conbr, pré-conbr, pré-cadeia alfa e fragmento gama tiveram sua expressão induzida na presença de metanol. A lectina expressa a partir do inserto pre-conbr e pro-conbr, na presença ou não do fator de secreção alfa, apresentou massa molecular aparente semelhante à massa da ConBr nativa (30 kDa). Os resultados sugerem que a rConBr é processada em células de P. pastoris. A expressão extracelular da ConBr recombinante foi dirigida tanto pelo fator alfa de secreção como pelo próprio peptídeo sinal da lectina. Na segunda etapa do trabalho, o gene conbr, na presença ou não da seqüência consenso Kozak, foi inserido em plantas de fumo (Nicotiana tabacum varo Xanthi) por cocultivo de discos foliares com Agrobacterium tumefaciens LBA4404 portando o plasmídeo binário pBI121::conbr ou pBI121::conbrK. A seqüência Kozak CACCAUGG foi inserida com o intuito de otimizar o processo de tradução da proteína recombinante. O processo de transformação permitiu a seleção de clones de fumo expressando a ConBr recombinante com massa molecular aparente superior à da ConBr nativa. Este constitui o primeiro relato da expressão da lectina de Canavalia brastliensis (ConBr) em sistemas heteróJogos eucariontes. Os dois sistemas de expressão estudados constituem ferramentas importantes para auxiliar no esclarecimento da biossíntese, processamento e atividade biológica da ConBr.
Abstract: Cloning and expression of the Canavalia brasiliensis lectin gene were obtained in two heterologous systems: the yeast Pichia pastoris and tobacco plants (Nicotiana tabacum varoXanthi). Six versions of the conbr gene coding for pre-pro-ConBr, pre-ConBr, pro-ConBr, pre-alpha-chain, beta fragment and gama fragment were cloned in Ptchia pastoris GS115 cells. The different inserts were obtained by primers designed frorn the nucleotide sequence of conbr gene (GenBank, access number Y13904). Each insert was subcloned on two different expression vectors, the pPICZaA and pPICZB. The first one allows the recombinant protein to be secreted extracellularly, whereas the second one allows intracellular expression. The transfonned yeast cells with the inserts pro-conbr, pre-conbr, pre-alpha chain and gama fragment were induced to express in the presence of methanol. The lectin expressed from the pre-conbr and pro-conbr inserts, with or without the alpha secretion factor, showed an apparent molecular mass similar to that ofthe native ConBr (30 kDa). These results suggest that rConBr was correctly processed in P. pastoris cells. Extracelular ConBr expression was directed by a secretion alpha factor or by the lectin peptide signal itself. At the second moment of this present research, the conbr gene, with or without the Kozak consensus sequence, was inserted in tobacco plants (Nicottana tabacum varoXanthi) by leaf disc co-culture with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 harboring binary plasmids, pBI121::conbr or pBI121::conbrK. The Kozak sequence CACCAUGG was inserted to improve translation of the recombinant protein. The transformation process allowed the selection of tobacco plants expressing the recombinant ConBr with an apparent molecularmass higher than that of the native ConBr. This is the first report of the C. brasiliensis lectin expression in eukariont heterologous systems. Both expression systems constitute important tools for elucidation of the biosynthesis, processing and biological activities of ConBr.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/46910
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