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Tipo: Tese
Título: Autofagia como mecanismo subjacente ao efeito imunomodulador do canabidiol em micróglia humana: relevância para efeito tipo-antidepressivo
Título em inglês: Autophagy as underlying mechanism for the immunomodulatory effect of cannabidiol in human microglia: relevance for its antidepressant-like effect
Autor(es): Chaves Filho, Adriano José Maia
Orientador: Gaspar, Danielle Macêdo
Palavras-chave em português: Micróglia;Autofagia;Canabidiol;Doenças Neuroinflamatórias;Depressão
Palavras-chave em inglês: Microglia;Autophagy;Cannabidiol;Neuroinflammatory Diseases;Depress
Data do documento: 2023
Citação: CHAVES FILHO, Adriano José Maia. Autofagia como mecanismo subjacente ao efeito imunomodulador do canabidiol em micróglia humana: relevância para efeito tipo-antidepressivo. 2023. 214 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2023. Disponível em: http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/74376. Acesso em: 18 set. 2023.
Resumo: O Canabidiol (CBD) é um composto da Cannabis sativa com efeitos imunomoduladores e potencial terapêutico em diversas doenças do SNC. Uma vez que a autofagia foi eleita como um mecanismo importante para o controle das funções microgliais, incluindo respostas inflamatórias, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da (macro)-autofagia nos efeitos do CBD em micróglia humanas ativadas. Para isso, no protocolo in vitro, células microgliais humanas HMC3 foram tratadas com CBD (1, 10, 50 e 100 µM) e 24h depois foram estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) por mais 24h (prevenção ou pré-tratamento). Além disso, outro grupo de células foi primeiramente exposto ao LPS por 24 horas, depois tratado com CBD (reversão ou pós-tratamento). Hidroxicloroquina (HCQ-10 µM) e privação de soro (STV por 2h) foram usados como inibidor e indutor de autofagia, respectivamente. A viabilidade celular foi avaliada através dos ensaios de MTT e LDH. A formação de organelas vesiculares ácidas (AVOS) foi determinada por meio do ensaio de laranha de acridina por citometria de fluxo. A expressão gênica das proteínas relacionadas à autofagia (ATGs) ATG5, ATG12, BECLIN-1 e p62/SQSTM1 foi determinada por real time-PCR. A expressão proteica das LC3B-I e LC3B-II, e p62/SQSTM1 foi determinada por western blott. Os sobrenadantes foram coletados para determinação de nitrito, TNFα, IL-1β, IFNγ, IL-4 e TGF-β, BDNF e atividade da arginase (Arg). A expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e Arg1 foi determinada por imunofluorescência. Atividade fagocítica foi medida através da detecção intracelular de esferas marcadas com fluoresceína; a migração celular foi avaliada através do ensaio de arranhão (scratch assay). No protocolo in vivo, camundongos Swiss machos foram tratados com HCQ (60 mg/kg, IP.) diariamente por 03 dias. No segundo dia, os animais receberam LPS (0.5 mg/kg, IP) ou salina (SAL), e no terceiro dia, foram tratados com CBD (10 mg/kg, IP), S-cetamina (10 mg/kg, IP) ou SAL. Foram realizados ensaios comportamentais para efeito tipo-antidepressivo, e as áreas cerebrais córtex pré-frontal (PFC) e hipocampo (HC) foram dissecadas. No protocolo in vitro, o CBD aumentou a % de células AVOS+ no protocolo de reversão em comparação com o LPS, o que foi bloqueado pelo co-tratamento com HCQ. STV aumentou o % de células AVOS+ em ambos os protocolos em comparação com os controles. O CBD aumentou os níveis de RNAm de ATG5 e p62/SQSTM1 no protocolo de prevenção, e ATG12 e p62/SQSTM1 no protocolo de reversão, em comparação com o LPS. O CBD no protocolo de reversão diminuiu significativamente os níveis de p62/SQSTM1 em comparação com os grupos controle e LPS. O CBD (10 µM) atenuou o aumento induzido por LPS nos níveis de nitrito, TNF-α e IL-1β em ambos os protocolos. O CBD aumentou os níveis de IL-4 e BDNF em ambos os protocolos, enquanto a atividade da arginase e TGF-β aumentaram apenas no protocolo de reversão. O STV em ambos os protocolos aumentou os níveis de mediadores anti-inflamatórios, e o co-tratamento com HCQ atenuou os efeitos do CBD na expressão desses marcadores. O CBD aumentou a atividade fagocitária e a migração celular em comparação com o grupo LPS. Esses efeitos foram igualmente bloqueados pela HCQ. No protocolo in vivo, o CBD parcialmente reverteu o comportamento tipo-depressivo induzido pelo LPS, restaurando o comportamento de autocuidado e reduzindo a latência no teste de alimentação suprimida pela novidade, o que foi atenuado pelo co-tratamento com HCQ. O CBD aumentou a expressão de LC3B-II no PFC, enquanto a S-cetamina aumentou essa proteína no HC em relação ao grupo LPS. Apenas a S-cetamina foi capaz de reduzir as concentrações de TNFα no HC dos animais desafiados com LPS. Em conjunto, nossos dados demonstram o efeito do CBD de promover indução de autofagia sobretudo nos estágios finais de degradação lisossomal em micróglia humanas desafiadas com LPS, o que parece ser fundamental para suas ações imunomoduladoras nessas células. Finalmente, agentes indutores de autofagia, como o CBD, podem ser ferramentas promissoras para o tratamento de doenças do SNC relacionados à neuroinflamação e disfunção microglial, como a depressão.
Abstract: Cannabidiol (CBD) is a non-psychostimulant compound from Cannabis sativa with immunoregulatory effects and therapeutic potential in several brain disorders. Since autophagy has been elected as an important mechanism for the control of microglial functions, including inflammatory responses, the aim of this study was to investigate the role of (macro)-autophagy in the CBD effects in pro-inflammatory activated human microglia. To do this, human microglia cells (HMC3 lineage) were treated with CBD (1, 10, 50 and 100 µM) and 24h later they were stimulated with lipopolysaccharide (LPS) for more 24h (prevention protocol or pretreatment). Also, other batch of cells were firstly exposed to LPS for 24 h, and 24h later treated with CBD (reversal protocol or post-treatment). Hydroxychloroquine (HCQ-10 µM) and starvation (STV) (2h) were used as autophagy inhibitor and inducer, respectively. Cell viability was evaluated through MTT and LDH assays. The formation of acidic vesicular organelles (AVOS) was determined through acridine-orange flow cytometry. Autophagy-related proteins (ATGs) gene expression (ATG5, ATG12, BECLIN-1 and p62/SQSTM1) was determined through RT-PCR. The protein expression of the isoforms LC3B-I and LC3B-II, an index of maturation of autophagossomes, and p62/SQSTM1, an index of degradation of the autophagic cargo, were determined through western blott. Supernatants were collected for determination of nitrite, TNFα, IL-1β, IFNγ, IL-4 and TGF-β, brain-derived neurotrophic levels (BDNF) and arginase activity. Also, the expression of the enzymes inducible nitric oxide synthase (iNOS) and Arginase1 (Arg1) was determined through immunofluorescence and their colocalization was evaluated. Phagocytosis was evaluated through fluorescein-labeled beads intracellular detection; migration-mobility was evaluated through scratch assay. In the in vivo protocol, adult Swiss mice were treated with HCQ (60 mg/kg, IP.), daily, for three days. On the second day, the animals were injected with LPS (0.5 mg/kg, IP) or saline (SAL), and on the third day, they were treated with CBD (10 mg/kg, IP), S-ketamine (10 mg/kg, IP) or SAL. Several behavioral assays were performed to evaluate the CBD’s antidepressant-like effect, and the mouse brain areas: prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HC) were collected. CBD increased the % of AVOS+ cells just in the reversal protocol compared to LPS, which was blocked by HCQ. STV increased AVOS+ cells in both protocols compared to controls. CBD increased some ATGs mRNA levels: ATG5 and p62/SQSTM1 in the prevention, and ATG12 and p62/SQSTM1 in the reversal protocol, compared to LPS. Additionally, CBD in the reversal protocol did not significantly increase the LC3B-I or II protein expression, but it significantly decreased the p62/SQSTM1 levels compared to control and LPS groups. CBD (10 µM) attenuated LPS-induced increase in nitrite levels, TNF-α and IL-1β in both protocols. CBD increased IL-4 and BDNF levels in both protocols, while arginase activity and TGF-β were increased only in the reversal one. STV in both protocols similarly increased the levels of anti-inflammatory mediators: IL-4, arginase activity and TGF-β compared to the LPS group. HCQ co-treatment attenuated CBD effects in the reversal protocol on nitrite and TNF-α levels, and significantly reduced the rise in IL-4, BDNF and arginase activity. CBD increased phagocytic activity in the reversal protocol, and increased cell migration in both protocols compared to LPS group. These effects were equally blocked by HCQ in the reversal protocol. In the in vivo protocol, CBD partially reversed LPS-induced depressive-like behavior, which was attenuated by co-treatment with HCQ. CBD increased the expression of LC3B-II in the PFC, while S-ketamine increased this protein in the HC compared to the LPS group. Only one S-ketamine was able to reduce TNFα concentrations in the HC of LPS-challenged animals. Therefore, this study contributes to a better understanding of the effects of CBD in microglia by providing evidence of the participation of autophagy-related mechanism to its immunoregulatory/anti-inflammatory actions. Finally, autophagy-inducer agents, possibly CBD, can be promising tools for microglia-related neuroinflammatory disorders, such as depression.
URI: http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/74376
Currículo Lattes do(s) Autor(es): http://lattes.cnpq.br/2644868771193886
Currículo Lattes do Orientador: http://lattes.cnpq.br/1566937332957369
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
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