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Tipo: Dissertação
Título: Avaliação dos efeitos de proteínas larvicidas contra Aedes aegypti sobre o peixe-zebra (Danio rerio): toxicidade aguda em embriões e larvas e inibição de proteases intestinais
Título em inglês: Evaluation of the effects of larvicidal proteins against Aedes aegypti on the zebrafish (Danio rerio): acute toxicity in embryo and larvae and inhibition of intestinal proteases
Autor(es): Gonçalves, Íris Flávia de Sousa
Orientador: Farias, Davi Felipe
Coorientador: Carvalho, Ana de Fátima Fontenele Urano
Palavras-chave: Inseticidas biológicos;Inibidor de proteases;Avaliação de risco;Peixe-zebra;Ecotoxicologia
Data do documento: 2022
Citação: GONÇALVES, Íris Flávia de Sousa. Avaliação dos efeitos de proteínas larvicidas contra Aedes aegypti sobre o peixe-zebra (Danio rerio): toxicidade aguda em embriões e larvas e inibição de proteases intestinais. 2022. 60 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2022.
Resumo: Há vários anos tem sido investigada na flora da Caatinga a presença de compostos com propriedades inseticidas contra o vetor da dengue, o mosquito Aedes aegypti. Um desses compostos, é o inibidor de tripsina obtido de sementes da espécie vegetal Leucaena leucocephala (LTI). O LTI é capaz de retardar o desenvolvimento e causar mortalidade das larvas, além de atuar de forma deletéria sob a eclodibilidade dos ovos do mosquito. Este inibidor também potencializa a atividade da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), que é um dos biopesticidas mais estudados. Aliando suas propriedades bioquímicas e inseticidas, essas moléculas são ótimas candidatas para o desenvolvimento de fitoinseticidas. Contudo, durante o desenvolvimento desses produtos, a avaliação da segurança para uso em ambiente aquático é uma etapa importante, especialmente avaliando o seu efeito sobre organismos não-alvos. Nesse contexto, o peixe-zebra (Danio rerio) consiste em um vertebrado modelo com inúmeras vantagens para este tipo de estudo, dentre elas, está a sensibilidade das fases iniciais de sua vida a estressores ambientais. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos das proteínas larvicidas contra Ae. aegypti, LTI e protoxinas Bt, ao organismo modelo peixe-zebra no que concerne à avaliação de toxicidade aos seus estágios iniciais de vida e à presença de efeitos inibitórios do LTI sobre proteases intestinais desse peixe. Para isso, foi realizado teste de toxicidade aguda do LTI e protoxinas Bt, de forma isolada e combinada, em embriões e larvas de peixe-zebra. Além disso, foi investigado a possível interação entre o LTI e da tripsina do peixe-zebra com o auxílio de ferramentas computacionais, bem como foi obtido o extrato intestinal do peixe-zebra adulto de ambos os sexos para avaliação da presença de atividade inibitória de tripsina do LTI numa perspectiva de inferir sobre possíveis prejuízos ao processo digestório, nutrição e desenvolvimento de peixes expostos a essa formulação. Os resultados mostraram que concentrações de LTI (250 mg/L), Bt (0,13 mg/L) e LTI + Bt (250 mg/L + 0,13 mg/L), 10 vezes superiores àquelas com ação inseticida, não causaram mortes e nem induziram mudanças morfológicas durante o desenvolvimento embrionário e larval (3 a 144 hpf) de peixe-zebra. As análises de “docking molecular” evidenciaram a interação entre o LTI e a tripsina de peixe-zebra através de interações hidrofóbicas, além de uma ligação de hidrogênio entre a Arg58 do LTI e a His23 da tripsina. De fato, o LTI (0,1 mg/mL) foi capaz de inibir in vitro a atividade tripsínica dos extratos intestinais de peixes fêmeas e machos em 83 e 85%, respectivamente, enquanto a mistura LTI e Bt (ambos na concentração de 0,1 mg/mL) promoveu inibição de 69 em fêmeas e 65% em machos. Este achado sugere um potencial efeito antinutricional do LTI e da sua mistura com Bt a organismos não alvo em concentrações próximas àquelas que apresentam ação larvicida. Em geral, esses dados levam à conclusão de que, em um ambiente natural, essa mistura larvicida pode apresentar efeitos deletérios em organismos aquáticos, especialmente àqueles com digestão proteica dependente de enzimas do tipo tripsina.
Abstract: For several years, the presence of compounds with insecticidal properties against the dengue vector, the Aedes aegypti mosquito, has been investigated in the flora of the Caatinga. One of these compounds is the trypsin inhibitor obtained from seeds of the plant species Leucaena leucocephala (LTI). LTI is capable of delaying the development and causing mortality of larvae, in addition to acting in a deleterious way on the hatching of mosquito eggs. This inhibitor also potentiates the activity of the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), which is one of the most studied biopesticides. Combining their biochemical and insecticidal properties, these molecules are excellent candidates for the development of phytoinsecticides. However, during the development of these products, safety assessment for use in the aquatic environment is an important step, especially evaluating their effect on non-target organisms. In this context, the zebrafish (Danio rerio) is a model vertebrate with numerous advantages for this type of study, among them is the sensitivity of the early stages of its life to environmental stressors. Thus, the present work aimed to evaluate the effects of larvicidal proteins against Ae. aegypti, LTI and Bt protoxins, to the zebrafish model organism regarding the assessment of toxicity to its early life stages and the presence of inhibitory effects of LTI on intestinal proteases of this fish. For this, an acute toxicity test of LTI and Bt protoxins, isolated and combined, was performed in zebrafish embryos and larvae. In addition, the possible interaction between LTI and zebrafish trypsin was investigated with the aid of computational tools, as well as the intestinal extract of adult zebrafish of both sexes was obtained to evaluate the presence of trypsin inhibitory activity of the LTI to infer possible damages to the digestive process, nutrition and development of fish exposed to this formulation. The results showed that concentrations of LTI (250 mg/L), Bt (0.13 mg/L) and LTI + Bt (250 mg/L + 0.13 mg/L), 10 times higher than those with insecticidal action, did not cause deaths nor induce morphological changes during embryonic and larval development (3 to 144 hpf) of zebrafish. The molecular docking analysis showed the interaction between LTI and zebrafish trypsin through hydrophobic interactions, in addition to a hydrogen bond between Arg58 of LTI and His23 of trypsin. In fact, LTI (0.1 mg/mL) was able to inhibit in vitro the trypsin activity of intestinal extracts from female and male fish by 83 and 85%, respectively, while the mixture LTI and Bt (both at a concentration of 0.1 mg/mL) promoted inhibition of 69 in females and 65% in males. This finding suggests a potential anti-nutritional effect of LTI and its mixture with Bt to non-target organisms at concentrations close to those that have larvicidal action. In general, these data lead to the conclusion that, in a natural environment, this larvicidal mixture can have deleterious effects on aquatic organisms, especially those with protein digestion dependent on trypsin-like enzymes.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/70024
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