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http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/68071| Tipo: | TCC |
| Título: | Desenvolvimento de estratégia de produção de L-asparaginase humana expressa em Escherichia coli |
| Título em inglês: | Development of a production strategy for human L-asparaginase expressed in Escherichia coli |
| Autor(es): | Pereira, Liandra Éllen Coelho |
| Orientador: | Magri , Agnes |
| Coorientador: | Araújo, Marjory Lima Holanda |
| Palavras-chave: | Biofármaco;Leucemia linfoblástica aguda (LLA);Planejamento fatorial;Corpos de inclusão |
| Data do documento: | 2022 |
| Citação: | PEREIRA, Liandra Éllen Coelho. Desenvolvimento de estratégia de produção de L-asparaginase humana expressa em Escherichia coli. 2022. 76 f. Monografia (Graduação em Biotecnologia) – Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2022. |
| Resumo: | A enzima L-asparaginase (L-ASNase) é um importante biofármaco usado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA). As principais L-ASNases oncoterápicas comerciais são bacterianas, mas apresentam efeitos adversos imunogênicos, com isso, busca-se por L- ASNases alternativas, como as similares à estrutura humana. O estudo teve como objetivo otimizar as condições de expressão de uma L-asparaginase humana do tipo 1 (hASNaseI) expressa em Escherichia coli, na forma de corpos de inclusão, seguindo planejamento fatorial Box–Behnken 3 3 . Para isso, foram utilizadas três variáveis independentes que afetam a produção de hASNaseI: tempo de expressão (h), concentração de IPTG (mM) e temperatura de indução ( o C), avaliadas em três níveis. Os cultivos de E. coli foram inoculados com 2% de inóculo, em duplicata, em meio Terrific Brith (TB), suplementado com antibióticos canamicina e cloranfenicol. Para obtenção da hASNaseI intracelular, os pellets celulares foram rompidos por sonicação e posteriormente, centrifugados. O sobrenadante e o precipitado foram avaliados por SDS-PAGE e pelo método de BCA, para quantificação da hASNaseI e proteínas totais em cada uma das frações. A caracterização dos corpos de inclusão, a solubilização e o redobramento foram avaliados. Foi observado que hASNaseI é expressa majoritariamente em corpos de inclusão. As análises estatísticas revelaram uma resposta máxima para produção de L-asparaginase no precipitado, na condição de 0,3 mM de IPTG, a 31 °C e 6 h de expressão, em que as condições se encontravam nos seus pontos centrais. O modelo se mostrou com alta significância para avaliação da produção de enzima. Para a otimização, foi realizada a adequação dos níveis das variáveis, a fim de se alcançar o ponto ótimo para produção de hASNaseI em corpos de inclusão, que foi de 0,24 mM de IPTG, a 30,57 °C e 8 h de expressão. Os corpos de inclusão apresentaram um diâmetro hidrodinâmico de 1000 nm, ausência de estruturas β-amiloides, e sua solubilização foi possível com solução Tris 100 mM, pH 12,5, Triton X-100 0,5%. Esse trabalho trouxe novas reflexões sobre o processo de produção do antileucêmico hASNaseI, assim como a validação desse processo a partir do uso de ferramentas estatísticas ideais para estudos de processos fermentativos em um período otimizado. Além disso, identificou-se uma produção majoritária da enzima na forma de corpos de inclusão e entendeu-se sobre a característica estrutural do corpo de inclusão, assim como estratégias de solubilização e redobramento desses aglomerados, etapas que representam hoje um desafio industrial. |
| Abstract: | The enzyme L-asparaginase (L-ASNase) is an important biopharmaceutical used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). The main commercial oncotherapeutic LASNases are bacterial, but they present immunogenic adverse effects, therefore, alternative LASNases, such as those similar to the human structure, are sought. The study aimed to optimize the expression conditions of a human L-asparaginase type 1 (hASNaseI) expressed in Escherichia coli, in the form of inclusion bodies, following a Box–Behnken 3 3 factorial design. Three independent variables were used that affect hASNaseI production: expression time (h), IPTG concentration (mM) and induction temperature ( o C), evaluated at three levels. E. coli cultures were inoculated with 2% inoculum, in duplicate, in Terrific Brith (TB) medium, supplemented with kanamycin and chloramphenicol antibiotics. To obtain intracellular hASNaseI, cell pellets were disrupted by sonication and subsequently centrifuged. The supernatant and the precipitate were evaluated by SDS-PAGE and by the BCA method, for quantification of hASNaseI and total proteins in each of the fractions. The characterization of inclusion bodies, solubilization and refolding were evaluated. It was observed that hASNaseI is expressed mainly in inclusion bodies. Statistical analyzes revealed a maximal response for L-asparaginase production in the precipitate, in the condition of 0.3 mM IPTG, at 31 °C and 6 h of expression, where the conditions were at their midpoints. The model proved to be highly significant for evaluating enzyme production. For the optimization, the adequacy of the levels of the variables was carried out, in order to reach the optimal point for the production of hASNaseI in inclusion bodies, which was 0.24 mM of IPTG, at 30.57 °C and 8 h of expression. The inclusion bodies showed a hydrodynamic diameter of 1000 nm, absence of βamyloid structures, and their solubilization was possible with 100 mM Tris solution pH 12.5, Triton X-100 0.5%. This work brought new reflections on the production process of the antileukemic hASNaseI, as well as the validation of this process from the use of ideal statistical tools for studies of fermentation processes in an optimized period. In addition, a majority production of the enzyme in the form of inclusion bodies was identified and the structural characteristic of the inclusion body was understood, as well as strategies for solubilization and refolding of these agglomerates, steps that currently represent an industrial challenge. |
| URI: | http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/68071 |
| Aparece nas coleções: | BIOTECONOLOGIA - Monografias |
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