Caracterização bioquímica e avaliação das atividades citotóxica e alergênica de uma proteína transferidora de lipídeos isolada de sementes de Morinda citrifolia L. (Rubiaceae)

Lutif, Camila Castro

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Type:	Dissertação
Title:	Caracterização bioquímica e avaliação das atividades citotóxica e alergênica de uma proteína transferidora de lipídeos isolada de sementes de Morinda citrifolia L. (Rubiaceae)
Title in English:	Biochemical characterization and evaluation of cytotoxic and allergenic activity of transferring protein isolate lipid Morinda citrifolia L. seeds (Rubiaceae)
Authors:	Lutif, Camila Castro
Advisor:	Oliveira, Hermógenes David de
Keywords:	Bioquímica;Morinda citrifolia L.;Proteínas transferidoras de lipídeos;McLTP1;Caracterização bioquímica;Citotoxicidade
Issue Date:	2015
Citation:	LUTIF, C. C. (2015)
Abstract in Brazilian Portuguese:	Morinda citrifolia L. é uma espécie nativa do Sudeste da Ásia intensamente investigada em função de suas propriedades terapêuticas reportadas há mais de 2.000 anos. Recentemente, uma proteína transferidora de lipídeos denominada McLTP1 (UniProt Accession Number: C0HJH5) foi isolada de sementes de noni pelo nosso grupo de pesquisa. McLTP1 é uma proteína termoestável de massa molecular 9,4 kDa, resistente à proteólise e dotada de atividades moduladoras da inflamação e da dor pela via oral, promissoras e inéditas para esse grupo de moléculas. Este trabalho objetivou caracterizar bioquimicamente McLTP1, bem como avaliar o seu potencial alergênico em camundongos, como etapas básicas para o seu uso racional e seguro do ponto de vista farmacológico. Em adição, as propriedades terapêuticas de McLTP1 foram também ampliadas, através da investigação de seu efeito citotóxico em diferentes linhagens de células tumorais. A proteína em estudo foi isolada utilizando o protocolo já estabelecido, envolvendo as etapas de precipitação seletiva de proteínas do extrato total das sementes de noni com ácido tricloroacético 2,5% e cromatografia de exclusão molecular. O ensaio de alergenicidade in vivo foi conduzido após prévia aprovação pelo Comitê de Ética para Uso de Animais da Universidade Federal do Ceará e utilizou fêmeas nulíparas com massa corporal entre 25 e 30 g. McLTP1 apresentou in vitro atividades inibitórias de tripsina (767,10 ± 8,36 UIT/mgP), quimotripsina (25,36 ± 0,86 UI/mgP), papaína (65,419 ± 0,152 UI/mgP) e alfa-amilase (24,40%). A atividade inibitória de tripsina de McLTP1 foi reduzida significativamente em temperaturas superiores a 37 ºC, apresentando atividade residual de apenas 5,91% quando aquecida a 100 ºC por 30 min. Essa atividade foi também influenciada pelo pH, sendo de apenas 30,13% e 39,05% quando a proteína foi incubada em tampões de pH 3,0 e 12,0. O padrão de oligomerização de McLTP1 demonstrou a formação de agregados diméricos/tetraméricos delimitando um canal central de diâmetro de 4,4 nm. As análises espectroscópicas mostraram que McLTP1 apresenta espectro de CD similar àquele apresentado por outras proteínas transferidoras de lipídeos e característico de proteínas ricas em alfa-hélice. Espectro de CD de McLTP1 não mostrou alterações significativas em diferentes temperaturas e pHs, corroborando com os dados de estabilidade obtidos anteriormente. Diferentemente, em condições redutoras (DTT 1 mM) o espectro de CD mostrou alteração na estrutura secundária da proteína e os mínimos e máximos de elipticidade molar foram também alterados na presença de micelas iônicas de SDS (10 mM). McLTP1 apresentou atividade citotóxica seletiva contra células de câncer de ovário (Ovcar-8; CI50: 16,6 μg/mL), não sendo citotóxica para as células tumorais de cólon humano (HCT-116), leucemia humano (HL-60) e glioblastoma humano (SF-295) testadas. McLTP1 foi capaz de promover hemólise significativa em hemácias de coelho a partir da concentração de 0,005 mgP/mL. McLTP1 apresentou potencial efeito alergênico in silico e em camundongos imunizados pela via oral, induzindo a síntese de anticorpos IgG e IgG1. Tal como descrito na literatura para outras LTPs, anticorpos anti-McLTP1 produzidos em coelho foram também capazes de reconhecer proteínas presentes em extratos de Rosaceae, Cucurbitaceae e na polpa do fruto de noni. Os dados obtidos permitiram caracterizar parcialmente a proteína em estudo, bem como avaliar o seu potencial imunogênico após administração oral. Novos testes serão conduzidos objetivando avaliar a importância clínica dessas respostas, uma vez que testes de toxicidade demonstraram que McLTP1 não foi capaz de promover reações adversas em camundongos, mesmo após administração da dose de 8 mg/kg por 28 dias.
Abstract:	This work reports the biochemical characterization, cytotoxic and allergenic effects of a lipid transfer protein isolated from M. citrifolia seeds (McLTP1), with trypsin and alpha-amylase inhibition properties. McLTP1 was purified with a procedure involving trichloroacetic acid precipitation and gel filtration chromatography. This protein showed significant inhibitory activities against trypsin (767,10 ± 8,36 TIU/mgP), chymotrypsin (25,36 ± 0,86 IU/mgP), papain (65,419 ± 0,152 IU/mgP) and alpha-amylase (24,40%). Atomic force microscopy displayed that McLTP1 oligomerized in tetramers showing a central channel. Fluorescence and CD assays revealed that the McLTP1 structure is highly stable, regardless of pH and temperature levels. In vitro, McLTP1 presented a selective cytotoxic effect to human ovarian cancer cells (OVCAR-8; IC50 of 16,6 μg/mL) and demonstrated hemolytic effect against fresh rabbit red blood cels. Similarly to other non-specific lipid transfer protein reported, McLTP1 showed allergenic properties in mice, being considered as a true food allergen since it was able to sensitize the animals via the gastrointestinal tract.
Description:	LUTIF, Camila Castro. Caracterização bioquímica e avaliação das atividades citotóxica e alergênica de uma proteína transferidora de lipídeos isolada de sementes de Morinda citrifolia L. (Rubiaceae). 2015. 121 f. Dissertação (mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015.
URI:	http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/16472
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