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Tipo: Tese
Título: Desenvolvimento de peptídeos tripanocidas otimizados a partir da dinoponeratoxina M-PONTX-Dq3a
Autor(es): Monteiro, Marilia Lopes
Orientador: Martins, Alice Maria Costa Nunes
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi;Doença de Chagas;Peptídeos Antimicrobianos;Lisina;Venenos de Artrópodes
Data do documento: 27-Out-2022
Citação: MONTEIRO, M. L. Desenvolvimento de peptídeos tripanocidas otimizados a partir da dinoponeratoxina M-PONTX-Dq3a. 2022. 108 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2022. Disponível em: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/69794. Acesso em: 19 dez. 2022.
Resumo: A doença de Chagas afeta milhões de pessoas em todo o mundo. No Brasil, o benznidazol disponível possui eficácia limitada e efeitos adversos severos, diante disso existe a necessidade de buscar substâncias com potencial terapêutico. O peptídeo antimicrobiano M-PONTX-Dq3a, isolado do veneno da formiga Dinoponera quadríceps, mostrou melhor atividade tripanocida (in vitro) que as terapias atuais, porém o comprimento do peptídeo pode limitar suas possibilidades de alcançar aplicação clínica. Neste trabalho foi investigado o efeito antichagásico de dois fragmentos e oito analogos de M-PONTX-Dq3a com o intuito de melhorar a atividade antichagásica, e reduzir os custos de produção. Os fragmentos e análogos de M-PONTX-Dq3a tiveram sua toxicidade avaliada nas células hospedeiras LLC-MK2, sendo observada maior C50 para o fragmento M- PONTX-Dq3a[3-15] (188,86 μM) e para os análogos substituídos por lisina com a EC50 variando entre (60 μM e 97 μM) , o efeito sob as formas tripomastigotas, foi observado menores valores de EC50 para o fragmento M- PONTX-Dq3a[1- 15] (0,59 μM) e para os análogos substituídos por lisina variando entre (0,86μM e 1,09μM), o índice de seletividade (IS) foi determinado, e foram selecionados os peptídeos mais promissores, o fragmento M-PONTX-Dq3a[1-15] (IS=72,9) e o análogo [Lys]3 -M-PONTX- Dq3a[3-15] (IS=85,3). Posteriormente foram analisados o efeito em formas epimastigotas, M- PONTX-Dq3a [1-15] demonstrou a menor EC50 em 24 horas (7,2 μM) e não demonstrou uma alteração significativa entre os tempos de 48 e 72 horas, [Lys]3M-PONTX-Dq3a[1-15] demonstrou diferenças significativas entre as EC50 dos 3 tempos, sendo a EC50 de 24 horas a menor encontrada (13,5 μM), sob as formas amastigotas foi observado efeito promissor com os dois peptídeos testados nos tempos de 24h e 48h, foi obtido para M-PONTX-Dq3a [1-15] EC50 24h 1,32 μM e IS/24h 32,61; EC50 48h 0,37 μM e IS/48h 96,7 e para [Lys]3M-PONTX-Dq3a[1-15] foi obtido EC50 24h 0,91 μM e IS/24h 80,65; EC50 48h 0,28 μM e IS/48h 156,6). Os resultados foram expressos em média ± E.P.M e considerado p < 0,05. Na busca sobre o mecanismo de ação dos peptídeos selecionados, foram observados alterações por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e marcações na citometria de fluxo sugerindo a necrose como principal mecanismo de ação, também foi observado o aumento em torno de 50% de espécies reativas de oxigênio em ambos os peptídeos testados e dano mitocondrial em cerca de 50% com o tratamento do [Lys]3M-PONTX-Dq3a[1-15]. O docking molecular foi realizado com as enzimas cruzaína, tripanotiona redutase e TcGAPDH, demonstrando que M-PONTX-Dq3a[1-15] se acoplou em diferentes sitos catalíticos de cada uma das enzimas testadas, enquanto [Lys]3 -M-PONTX- Dq3a[3-15] se acoplou a tríade catalítica da cruzaína. Em conclusão, os estudos levaram à identificação de dois peptídeos menores, o fragmento M-PONTX-Dq3a[1-15] e o fragmento análogo [Lys]3-M-PONTX-Dq3a[3-15]com atividade antichagásica semelhante e superior respectivamente, quando comparado ao índice de seletividade do peptídeo parental .
Abstract: Chagas disease affects millions of people around the world. In Brazil, the available drug has limited efficacy and severe adverse effects, so there is a need to seek substances with therapeutic potential. The antimicrobial peptide M-PONTX-Dq3a, isolated from the venom of the ant Dinoponera quadriceps, showed better trypanocidal activity (in vitro) than current therapies, but the length of the peptide may limit its possibilities of achieving clinical application. In this work, the antichagasic effect of two fragments and eight analogues of M-PONTX-Dq3a was investigated in order to improve the antichagasic activity and reduce production costs. The M- PONTX-Dq3a fragments and analogues had their toxicity evaluated in LLC-MK2 host cells, with a higher EC50 being observed for the M-PONTX-Dq3a[3-15] fragment (188.86 μM) and for the analogues substituted by lysine with EC50 varying between (60 μM and 97 μM), the effect on the trypomastigote forms, lower EC50 values were observed for the M-PONTX- Dq3a[1-15] fragment (0.59 μM) and for the analogs substituted by lysine varying between (0.86μM and 1.09μM), the selectivity index (SI) was determined, and by means of the WHO criteria, the most promising peptides were selected, the fragment M-PONTX-Dq3a[1-15 ] (IS=72.9) and the analog [Lys]3-M-PONTX-Dq3a[3-15] (IS=85.3). Subsequently, the effect on epimastigote forms was analyzed, M-PONTX-Dq3a [1-15] showed the lowest EC50 at 24 hours (7.2 μM) and did not show a significant change between the times of 48 and 72 hours, [Lys] 3M-PONTX-Dq3a[1-15] showed significant differences between the EC50 of the 3 times, with the 24-hour EC50 being the lowest found (13.5 μM) and under the amastigote forms a promising effect was observed with the two peptides tested in the times of 24h and 48h, it was obtained for M-PONTX-Dq3a [1-15] EC50 24h 1.32 μM and IS/24h 32.61; EC50 48h 0.37 μM and IS/48h 96.7 and for [Lys]3M-PONTX-Dq3a[1-15] it was obtained EC50 24h 0.91 μM and IS/24h 80.65; EC50 48h 0.28 μM and IS/48h 156.6). Results were expressed as mean ± SEM and considered p < 0.05. In the search for the mechanism of action of the selected peptides, alterations were observed by scanning electron microscopy (SEM) and flow cytometry markings suggesting necrosis as the main mechanism of action, an increase of around 50% of reactive species was also observed. of oxygen in both peptides tested and mitochondrial damage by about 50% with the treatment of [Lys]3M-PONTX-Dq3a[1-15]. Molecular docking was performed with the enzymes cruzain, trypanothione reductase and TcGAPDH, demonstrating that M-PONTX-Dq3a[1-15] was coupled at different catalytic sites of each of the enzymes tested, while [Lys]3-M-PONTX- Dq3a[3-15] is coupled to the catalytic triad of cruzin. In conclusion, the studies led to the identification of two smaller peptides, the M-PONTX-Dq3a[1-815] fragment and the analog fragment [Lys]3-M-PONTX-Dq3a[3-15] with similar and superior antichagasic activity. respectively, when compared to the parental peptide selectivity index.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/69794
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