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Title in Portuguese: Estabelecimento de um modelo ex vivo de ferida crônica em pele porcina: uma abordagem comparativa com modelo in vitro para o estudo de biofilmes bacterianos
Title: Establishment of an ex vivo model of chronic wounds on porcine skin: a comparative approach with an in vitro model for the study of bacterial biofilms
Author: Santos Filho, Anísio Silvestre Pinheiro
Advisor(s): Maia, Débora Castelo Branco de Souza Collares
Keywords: Biofilmes
Técnicas In Vitro
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Issue Date: 10-Jul-2019
Citation: SANTOS FILHO, A. S. P. Estabelecimento de um modelo ex vivo de ferida crônica em pele porcina: uma abordagem comparativa com modelo in vitro para o estudo de biofilmes bacterianos. 2019. 54 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2019.
Abstract in Portuguese: A ferida crônica é uma doença incapacitante, intimamente relacionada ao envelhecimento e às doenças crônicas como diabetes, hipertensão arterial e obesidade.Estão associadas também aos biofilmes, responsáveis pela resistência aos antimicrobianos, persistência e progressão do quadro clínico, principalmente de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. Assim, desenvolver um modelo mais fidedigno com as condições in vivo é importante para a compreensão daetiopatogênese envolvida nesta interação. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo ex vivo de feridas crônicas para o estudo de biofilmes de S. aureuse deP. aeruginosa em pele suína e compará-lo com o modelo in vitro. Para tanto, três cepas de cada espécie foram avaliadas, sendo uma cepa controle (S. aureusATCC 29213 e P. aeruginosaATCC 27853) e duas cepas clínicas. Para o modelo ex vivo, fragmentos de pele de 1,5 x 1,5 cmforam desinfetados com álcool 70% e NaOH 12% e um orifício de 0,8 cm de diâmetro foi feito removendo a epiderme, onde o inóculo bacteriano de 1,5-1,8 x 109 UFC/mL (25 µL) foi depositado. Os biofilmes in vitroforam formados em placas de poliestireno, utilizando caldo BHI-glicose 1% (175 µL) e inóculo bacteriano de 1,5-1,8 x 109 UFC/mL (25 µL). Ambos foram incubados a 37 oC, por 48, 72, 96 e 120 h. Em cada período de avaliação, foi realizada contagem de UFC, quantificação das proteínas de matriz e produção de proteases e sideróforos. Os biofilmes ex vivo foram avaliados por microscopia óptica e microscopia confocal. Observou-se que as contagens de UFC e a quantificação de matriz de biofilmes de S. aureuse P. aeruginosaex vivo foram significativamente (P<0,05) maiores que aquelas de biofilmes in vitro, especialmente às 48 e 96 h de crescimento. A microscopia confocal dos biofilmes ex vivo demonstrou uma redução significativa (P<0.05) da biomassa e da espessura, a partir das 96 h, e uma maior (P<0.05) robustez, às 72 h de crescimento, para ambas as espécies. Quanto à produção de fatores de virulência, biofilmes de S. aureusex vivo produziram menos sideróforos e proteases que os biofilmes in vitro, enquanto que os biofilmes de P. aeruginosaex vivoproduziram mais sideróforos e menos proteases que aqueles crescidos in vitro. Os resultados demonstram que biofilmes ex vivoapresentam mais células, matriz, maior biomassa e robustez que aqueles crescidos in vitro, enfatizando a importância de se trabalhar com modelos ex vivo, pois esses mimetizam melhor o ambiente do hospedeiro e criam condições mais fidedignas para o estudo de feridas crônicas.
Abstract: The chronic injury is a disabling disease closely related to aging and to chronic diseases, such as diabetes, arterial hypertension and obesity. They are also associated to the biofilms, responsible to antimicrobial resistance, persistence and progression of the clinical picture, specially of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Thus, it is important, in order to better comprehend the etiopathogeneses involved on this relation, to develop a more reliable to the in vivo conditions model. Therefore, the aim of this study was to establish an ex vivo model of chronic injuries on porcine skin to the study of S. aureus and P. aeruginosa biofilms and compare them to the in vitro model. To do so, three strains of each species were evaluated, which one of these strains was the control case (S. aureus ATCC 29213 and P. aeruginosa ATCC 27853) and the other two were clinical strains. To the ex vivo model, fragments of skin measuring 1,5 cm x 1,5 cm were disinfected with 70% alcohol and 12% NaOH. An orifice measuring 0,8 cm of diameter was made to the removal of epidermis, where the bacterial inoculum of 1,5-1,8 x 109 CFU/mL (25 µL) was placed. The in vitro biofilms were formed on polystyrene plaques, using BHI broth supplemented with 1% of the glucoses (175 µL) and bacterial inoculum of 1,5-1,8 x 109 CFU/mL (25 µL). The in vitro and ex vivo biofilms were incubated at 37 ºC each for 48, 72, 96 and 120 hours. In each period of evaluation, the CFU counting and the quantification of the matrix proteins and the counting of proteases and siderophore production were made. The ex vivo biofilms were evaluated via optical microscopy and confocal microscopy. It was observed that the CFU counting and the quantification of the matrix of S. aureus and P. aeruginosa ex vivo biofilms were significantly (P < 0,05) greater than those of in vitro biofilms, especially the ones of 48-96 hours of growing. The confocal microscopy of ex vivo biofilms have shown one significant (P < 0,05) reduction of the biomass and the thickness, for 96 hours, and a greater (P < 0,05) robustness at 72 hours of growing, to both the species. In matters of the production of virulence factors, S. aureusex vivo biofilms produced fewer siderophore and proteases than in vitro biofilms, while P. aeruginosaex vivo biofilms produced more siderophore and fewer proteases than those which have grown in vitro. The results have shown that ex vivo biofilms presented more cells and matrix and greater biomass and robustness than those which have grown in vitro, emphasizing the importance of working with ex vivo models, once it mimics better the host environment and it creates more reliable conditions to the study of chronic injuries.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/50024
metadata.dc.type: Dissertação
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