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Title in Portuguese: Produção de β-galactosidase por kluyveromyces lactis NRRL Y1564 em soro de leite e imobilização em quitosana
Title: Production of β-galactosidase from kluyveromyces lactis NRRL Y1564 in whey and immobilization in chitosan
Author: Freitas, Maria de Fátima Matos de
Advisor(s): Gonçalves, Luciana Rocha Barros
Co-advisor(s): Rocha, Maria Valderez Ponte
Keywords: Engenharia química
Fermentação
Lactose
Enzimas
Íons
Reatores
Issue Date: 28-Feb-2013
Citation: FREITAS, M. F. M. de. Produção de β-galactosidase por Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 em soro de leite e imobilização em quitosana. 2013. 100 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química)-Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013.
Abstract in Portuguese: Neste trabalho, a enzima β-galactosidase, que catalisa a hidrólise da lactose em glicose e galactose, foi produzida pelo cultivo do micro-organismo Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 em soro de leite suplementado com extrato de levedura. A enzima é um metabólito intracelular, sendo a liberação da enzima para o meio uma condição essencial, por isso estudaram-se diferentes métodos químicos e mecânicos de extração como, agitação com pérolas de vidro, ruptura em ultrassom com pérolas de vidro, adição de etanol e tolueno, observando também, seus efeitos na atividade enzimática. Posteriormente, realizaram-se ensaios para estudar a influência da temperatura (30, 34, 37 e 40 °C) na produção da enzima a partir do soro de queijo. Na extração da enzima, o uso de esferas de vidro em vórtex foi o método mais eficiente quando comparado com os outros avaliados. A enzima, não sofreu inibição ou desnaturação quando incubadas com etanol, tolueno ou etanol-tolueno. A temperatura ótima de produção da enzima por K. lactis NRRL Y1564 foi 30 °C, com atividade enzimática de 4418,37 U/g de células em 12 h de fermentação. A enzima produzida foi imobilizada em quitosana 2,0% m/v. Diferentes protocolos de ativação usando glutaraldeído, epicloridrina ou glicidol foram avaliados. Estudou-se também, o tempo de contato enzima-suporte (3, 5 e 10 horas) a fim de se obter um biocatalisador que apresentasse alto rendimento, atividade recuperada e tempo de meia-vida, visando a hidrólise da lactose em reator batelada e leito fixo. A influência da temperatura e do pH na hidrólise da lactose foi avaliada, usando como substrato uma solução sintética (lactose 5,0% (m/v) e leite desnatado, contendo 4,3% m/v de lactose. O suporte que apresentou melhores resultados nos parâmetros de imobilização foi a quitosana 2% reticulada com glutaraldeído no tempo de imobilização de 5 horas. O biocatalisador produzido nesse estudo apresentou um fator de estabilidade de 17,37 vezes maior que a enzima solúvel, com uma estabilidade de armazenamento de 100% quando armazenada a 4 °C por 90 dias. A temperatura ótima de hidrólise da lactose foi de 40 °C e o pH ótimo foi 7,0 . A conversão da lactose a 40 °C para este derivado (3,0 U/g) foi em média 53% em 10 ciclos (bateladas consecutivas). Em reator batelada, a conversão em glicose a partir da hidrólise da lactose, usando solução sintética, foi aproximadamente 86 % para a enzima solúvel (3,8 U/mL) e 83 % para a enzima imobilizada (3,8 U/g). A conversão obtida na hidrólise do leite desnatado foi de 17 % para a enzima solúvel e 20 % para a enzima imobilizada.
Abstract: In this work, the enzyme β-galactosidase which catalyzes the hydrolysis of lactose to glucose and galactose, was produced by cultivating the micro-organism Kluyveromyces lactis NRRL Y1564 in whey supplemented with yeast extract. The enzyme is an intracellular metabolite, the release enzyme is very important, therefore were studied various chemical and mechanical methods of extraction and stirring with glass beads, sonication, addition of ethanol and toluene, noting also their effects on enzymatic activity. Subsequently, trials were carried out to study the influence of temperature (30, 34, 37 and 40 ° C) in the production of the enzyme from the cheese whey. In the enzyme extraction, using glass beads by a vórtex was more efficient method compared to others evaluated. The enzyme not presented inhibited or denatured when incubated with ethanol, toluene or ethanol-toluene. The optimum temperature for enzyme production by K. lactis NRRL Y1564 was 30 °C with enzymatic activity of 4418.37 U/g of cells at 12 h of fermentation. The enzyme produced was immobilized on chitosan 2.0% w/v. Different activation protocols using glutaraldehyde, epichlorohydrin or glycidol were evaluated. Was also studied, the contact time the enzyme-carrier (3, 5, and 10 hours) to obtain a biocatalyst to produce high yield, recovered activity and half-life in order to hydrolysis of lactose in batch reactor and fixed bed. The influence of temperature and pH on the hydrolysis of lactose was evaluated using as substrate a synthetic solution (lactose 5.0% (w/v) in potassium phosphate buffer 100 mM with 0.1 mM MnCl2) and skimmed milk containing 4.3% w/v lactose. The support shows better results in the parameters of immobilization was chitosan 2% actived with glutaraldehyde and contact time of 5 hours. The biocatalyst produced in this study showed a stability factor of 17.37 and a storage stability of 100% when stored at 4 °C for 90 days. Temperature optimum hydrolysis of lactose was 40 °C and the optimal pH 7.0. The conversion of lactose to 40 °C for this derivative (3.0 U/g) was on average 53% in 10 cycles (consecutive batches). In batch reactor, the conversion to glucose by the hydrolysis of lactose using synthetic solution was approximately 86% for the soluble enzyme (3.8 U/mL) and 83% of the immobilized enzyme (3.8 U/g). The conversion obtained in the hydrolysis of skim milk was 17% for the soluble enzyme and 20% for the immobilized enzyme.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/4795
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