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http://repositorio.ufc.br/handle/riufc/47107| Tipo: | Tese |
| Título: | Purificação, caracterização bioquímica e biológica e especificidade fina da lectina galactose-específica (VGL) de sementes de Vatairea guianensis Aublet |
| Autor(es): | Isidro, Renato |
| Orientador: | Cavada, Benildo Sousa |
| Data do documento: | 2002 |
| Citação: | ISIDRO, Renato. Purificação, caracterização bioquímica e biológica e especificidade fina da lectina galactose-específica (VGL) de sementes de Vatairea guianensis Aublet. 2002. 123 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2002. |
| Resumo: | Neste trabalho foram analisados aspectos bioquímicos e a especificidade fina de uma lectina de sementes da planta Vatairea guianensis Aublet. A partir da lectina purificada através de cromatografia de afinidade em coluna de guar-gum, foram investigados parâmetros estruturais da lectina c a especificidade de ligação a carboidratos complexos e glicoconjugados. Além disto, a habilidade da lectina de reconhecer glicoconjugados de superficie sobre células de diferentes linhagens de câncer do cólon humano foram avaliados. Para caracterizar a especificidade de ligação a carboidratos da lectina, denominada aqui como VGL, vários carboidratos solúveis e glicoproteínas foram testados quanto à capacidade de prevenir a atividade hemaglutinante da lectina; Além disto, foi avaliado a afinidade da lectina imobilizada em gel Sepharose 4B por oligossacarídeos e glicopeptídeos radio-marcados com 14C ou 3H com estruturas lineares bem definidas. A cinética de interação em tempo real da VGL solúvel com várias glicoproteínas imobilizadas foi analisada através da tecnologia de ressonância plasmônica de superficie em um aparelho BIACore 3000™. De um modo geral, A VGL é formada por uma mistura de subunidades intactas (cadeia a) e clivadas (B e y), contendo quantidades apreciáveis de uma lectina galactose/lactose específica. Nos ensaios de (ELISA), usando anticorpos policlonais de coelho produzidos anti-lectina de Vatairea macrocarpa (VML), a VGL mostrou-se parcialmente reconhecida por estes anticorpos. Em conjunto, os resultados obtidos através de eletroforese em gel, os de espectros de massa e ELISA sugere que a lectina, estudada do gênero Vatairea deve partilhar estreitas relações estruturais com a VML que poderão refletir em atividades biológicas similares. A VGL é urna glicoproteína com 3,6% de açúcares na molécula, com uma composição de 1 resíduo de fucose, 3 resíduos de mano se, 2 resíduos de N-acetil-glicosamina e 1 resíduo de xilose por molécula de lectina. Este é um dos glicanos mais comuns presentes em proteínas vegetais e ocorre também na VML. Nos ensaios de inibição por carboidratos simples, a VGL não interagiu com os monossacarídeos fucose, glicose, GlcNac e D-rnanose. No entanto, lactose, galactose e seu derivado N-acetilgalactosamina são inibidores. A interação entre a lectina e várias glicoproteínas, determinadas por inibição da atividade hemaglutinante, mostra que esta lectina reconhece resíduos de galactose e N-acetil-D-galactosamina da porção glicídica da asialo-Iactotransferrina humana, asialo-sorotransfeITÍna humana, asialofetuína e Iactotransferrina bovina. Entretanto, a especificidade :fina da VGL mostrou que alguns oligossacarídeos do tipo N-acetillactosamina B-Gal-(1-4)-B-G1cNAc que apresentaram duas. três ou quatro antenas foram reconhecidos pela lectina imobilizada e eluídos após o volume morto, sendo atrasadas em uma fração (FR+1), quando analisada em cromatografia de afinidade. A cinética da interação da lectina com várias glicoproteínas, medida em tempo real, mostrou que a VGL possui diferentes afinidades por estruturas glicanas propostas. O conjunto de resultados sugere que a VGL possui diversas características bioquímicas similares a lectina isolada de sementes de Vatairea macrocarpa e que notadamente evoluíram de um mesmo ancestral comum. Os resultados de citometria de fluxo revelaram que as duas lectinas isoladas de plantas do gênero Vatairea utilizadas neste estudo reconheceram, com maior ou menor intensidade, resíduos de carboidratos presentes na membrana plasmática de todas linhagens de células estudadas. Contudo, VML apresentou maior capacidade de distinguir os tipos celulares na medida em que apresentou maior afinidade por glicanos de superficie das linhagens celulares de acordo com os valores diferentes de Unidades de Fluorescência (UF) detectados. O fato de que as duas lectinas de Vatairea parecem não interagir com carboidratos complexos que possuem ácido siálico, as tomam candidatas a ferramentas no estudo de fracionamento e detecção de gliconjugados do tipo Nacetillactosamina que usualmente possuem ou não resíduos de ácido siálico na extremidade não redutora. |
| Abstract: | Biochemical aspects and fine specificity of the lectin from seeds of Vaitarea guianensis Aublet were analysed in the present work. The purified lectin obtained by affinity chromatography on Guar-Gum column was used to study both structural parameters and its specificity to bind to complex carbohydrates and glycoconjugates. Furtherrnore, the ability of the lectin to recognize glycoconjugates from the surface of different ceU tines of human colon cancer was also investigated. In a view to characterise the binding specificity of the lectin to carbohydrates, a large amount of soluble carbohydrates and glycoproteins were used to abolish the haemagglutinating activity exhibited by the lectin. Also, the affinity of the immobilized lectin into Sepharose 4B against radiolabeled oligossacharides and glycopeptides marked with 14Cor 3H of well-defined structures was determined. The kinetic interaction in real time of soluble VGL with various immobilized glycoproteins was analysed by surface plasmon resonance technology in a BIACore 3000™ apparatus. In general, VGL is formed by a mixture of both intact subunits (n-chain) and cleaved units (P and À.), containing an expressive amount of a galactose/lactose-specifíc lectin. VGL was partially recognized by rabbit polyclonal antibodies anti-VML by ELISA assay. PAGE-SDS, mass spectrum and ELISA data suggested that VGL might have similar structural relationships lea ing to similar biological activities. VGL is a glycoprotein with 3.6% sugar content, with one fucose, three mannose, two N-Acetyl-glycosarnine and one xylose residues per molecule. This glycan structure occurs in a large amount of plant proteins. Haemagglutination inhibition studies showed that the simple sugars fucose, glucose, N-acetyl-glucosamine, mannose and its derivatives did not abolish the agglutinatining activity exhibited by the lectin. However, lactose, galactose and its derivative N-acetyl-galactosamine showed to be inhibitors of the haemagglutinanting activity. The interaction of the lectin with several glycoproteins, measured by haemagglutinating activity showed that the lectin recognized galactose and Ncetyl- galactosamine residues into the core of the glycoproteins asialofetuin, human asialolactotransferrin, human asialo-sorotransferrin and bovine lactotransferrin. However, fine specificity studies by affinity chromatography showed that immobilized VGL recognizes some N-acetyl-lactosarnine B-Gal-(1-4)-B-GlcNAc type exhibiting two, three or four antennas since they were eluted after the void volume (FR+ 1). The kinetic interaction of the lectin with several glycoproteins in real time has shown that VGL possesses different affinity for the glycan structures. The results suggested that VGL exhibits similar characteristics to the lectin isolated from the seeds of Vatairea macrocarpa and that they probably evaluated from a common ancestor. Flux cytometry rcsults revealed that both lectins isolated from seeds of genus Vaitarea used in the present work recognized in different intensit some carbohydrate moieties in ali line of cells tested. However, VML exhibited more specificity to distinguish the cell lines since it exhibited more affinity for the glycans presented in the surface of the celI lines by the values of Fluorescence Units (FU) detected. As both lectins from genus Vaitarea appears not to bind to complex carbohydrates that possess sialic acid in their structure, make them an useful tool for the study and detection of N-acetyl-lactosamine type-glycoconjugates that have or not sialic acid residues in non-reducing extremity. |
| URI: | http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/47107 |
| Aparece nas coleções: | DBBM - Teses defendidas na UFC |
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