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Title in Portuguese: Purificação e caracterização biológica da lectina recombinante de Canavalia brasiliensis (rConBr) produzida em Escherichia coli
Author: Nogueira, Nádia Accioly Pinto
Advisor(s): Grangeiro, Thalles Barbosa
Keywords: Biologia molecular
Proteína recombinante
Escherichia coli
Canavalia brasiliensis
Issue Date: 1999
Citation: NOGUEIRA, Nádia Accioly Pinto. Purificação e caracterização biológica da lectina recombinante de Canavalia brasiliensis (rConBr) produzida em Escherichia coli. 1999. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 1999.
Abstract in Portuguese: O gene conbr codificando a pre-pro-ConBr foi expresso em células de Escherichia coli BL21(ÀDE3) transformadas com o plasmídio pETconbr e induzidas pelo IPTG 1 mM. A expressão da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protéica com massa molecular aparente de 37 kDa após a indução da expressão com IPTG 1 mM, por ensaios de PAGE-SDS. A rConBr foi sintetizada como uma proteína de fusão contendo uma cauda adicional de seis resíduos de Histidina em sua porção N-terminal, o que tornou possível sua purificação por cromatografia de afinidade em níquel imobilizado. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusão insolúveis no citoplasma bacteriano, atingindo uma produção de 15-30 mg/litro de meio de cultivo. A rConBr foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-ConBr, e apresentou uma seqüência N-terminal homóloga a do precursor da ConBr, indicando que a bactéria não é capaz de realizar nenhum processamento co- e pós-traducional, que ocorre nas células do vegetal. Entretanto mostrou ser potencialmente ativa ao ligar resíduos de carboidratos quando submetida à cromatografias de afinidade em colunas de Sephadex G-50, Sephadex G-75 e Manose-Agarose, aglutinar eritrócitos de coelho tratados com proteinases (bromelaína, papaína e tripsína), e induzir respostas inflamatórias em ratos. Assim como a ConBr nativa, a rConBr induziu a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de ratos, induziu o desenvolvimento de edema de pata em rato e causou a degranulação de mastócitos peritoneais murinos, com conseqüente liberação de histamina. Entretanto, a rConBr foi menos potente na indução de todas as atividades biológicas testadas, quando comparada com a ConBr nativa. De acordo com os resultados obtidos podemos sugerir que a ocorrência de processamentos co- e pós-traducionais é necessária para produzir uma lectina com atividade biológica plena. Dessa maneira, a remoção do peptídeo sinal, do peptídeo ligante e da extensão C-terminal é imprescindível para produzir uma lectina com uma conformação espacial biologicamente ativa.
Abstract: ConBr is a D-glucose/D-mannose binding lectinis isolated from Canavalia brasiliensis seeds. Like ConA, ConB rissynthesized during seed development as a pre-prolectin which undergoes a complex series of pos-translational events to produce the mature lectin. The pre-pro-ConBr was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. The recombinant lectin (rConBr) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl B-D-thiogalactopyranoside. AlI the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. After solubilization of the inclusion bodies with 6M guanidine hydrochloride, rConBr was purified to homogeneity under denaturing conditions using Ni2+ affinity chromatography. The recombinant lectin, obtained at ayield of 15 - 30 mg/l culture, had a higher molecular mass (37 kDa) than the native lectin (30 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the pre-pro-ConBr is not processed in E. coli cells. The identity of the expressed protein as the unprocessed pre-pro-ConBr was confirmed by N-terminal protein sequencing. The recombinant lectin was able to bind carbohydrates, to agglutinate rabbit erythrocytes and to induce pro-inflammatory effects in rats and histamine release from rat mast cells. However, rConBr was far less potent than the native lectin regarding its biological activities. Therefore, the complex posttranslational events that takes place in the plant during ConBr biosynthesis seem to be necessary to produce a thoroughly active lectin.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/44565
metadata.dc.type: Tese
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