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Title in Portuguese: ConA e ConBr previnem aumento de [Ca2+]c e necrose de células acinares pancreáticas e melhoram pancreatite aguda alcoólica experimental
Title: ConA and ConBr prevent increased [Ca2+]c and necrosis of pancreatic acinar cells and improve experimental acute alcoholic pancreatitis
Author: Damasceno, Samara Rodrigues Bonfim
Advisor(s): Soares, Pedro Marcos Gomes
Keywords: Pancreatite Alcoólica
Morte Celular
Issue Date: 4-Feb-2019
Citation: DAMASCENO, S. R. B. ConA e ConBr previnem aumento de [Ca2+]c e necrose de células acinares pancreáticas e melhoram pancreatite aguda alcoólica experimental. 2019. 145 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2019.
Abstract in Portuguese: Etanol/POA causa elevações de cálcio, colapso mitocondrial, necrose de células acinares pancreáticas e pancreatite aguda experimental, sendo um dos melhores modelos caracterizados para o estudo da pancreatite aguda alcoólica, a qual até o presente momento não dispõe de tratamento eficaz que tenha levado à sua cura. Nesse sentido as lectinas ConA e ConBr possuem atividades biológicas importantes de proteção celular e sistêmica em diversos modelos de doença, e dessa forma, apresentam-se como potencial alternativa terapêutica. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de ConA e ConBr na lesão pancreática causada por Etanol/POA “in vitro” e “in vivo”. Células acinares foram isoladas de pâncreas de camundongos Swiss machos e de humanos, incubadas com ConA ou ConBr (10 µg/mL, 1h), seguido da incubação com Etanol/POA (100 µM, 30 min). Para análise da participação dos canais de cálcio, foi utilizado tapsigargina (2 µM, inibidor da bomba de Ca2+ do Retículo Endoplasmático-SERCA). Para avaliar o domínio lectínico, as lectinas foram incubadas por 1h, com α-metil-manosídeo (α-MM; 0,1M). ConA ou ConBr acopladas à fluoresceína foram usadas para avaliação de sua interação com a célula acinar. As análises foram realizadas utilizando fluoróforos e avaliadas em microscópio confocal ou fluorímetro. Dados expressos como média ± erro padrão da média e considerados estatísticos quando p<0,05. Etanol/POA (24,9±2,6%) causou significativa (P<0.05) necrose nas células acinares murinas, comparado ao controle (9,0 ± 2,6%), mas foi prevenida por ConA (8,1±1,3%) e ConBr (9,4±0,8%). Esse efeito protetor foi abolido por α-MM (ConA: 19,1±3,5 e ConBr: 26,9±6,4%). Em células acinares humanas ConA (64,21 ± 7,82 %) e ConBr (61,70 ± 4,70 %) também diminuíram a necrose causada por Etanol/POA (84,37 ± 3,45 %). Etanol/POA (488,3±25,07 AUC) aumentou os níveis de [Ca2+]c, comparado ao controle (203,3±1,2 AUC), o qual foi diminuído por ConA (304,7±12,79 AUC) e ConBr (262,6±15,42 AUC). Na avaliação dos canais de Ca2+ operados por estoque (SOCs), a administração de 10 mM de Ca2+ em células pré-incubadas com TPG aumentou os níveis de [Ca2+]c (2090±139,5 AUC), comparado ao controle (190,3±2,8 AUC); sendo prevenido por ConA (1395±104,6 AUC) e ConBr (1132±131,2 AUC). Etanol/POA aumentou [Ca2+]c pela interação com receptores de inositol trifosfato (IP3R) (413,4±28,30 vs Controle: 193,3±2,8 AUC), ConA e ConBr preveniram esse efeito (220,8±08,03 e 232,0±20,52 AUC, respectivamente). Etanol/POA (1248±105,2 AUC) promoveu aumento de [Ca2+]mit, comparado ao controle (189,4±3,7), o qual foi revertido por ConA e ConBr (444,8±22,86 e 440,3±67,82 AUC, respectivamente). Contudo, as lectinas não preveniram a entrada de cálcio em mitocôndrias isoladas, na análise de MPTP (Etanol/POA: 0,32±0,06 vs ConA: 0,31±0,05 e ConBr: 0,32±0,06). ConA e ConBr (13,41±1,1 e 13,25±1,1, respectivamente) preveniram a liberação de amilase intra-acinar causada por Etanol/POA (18,7±2,2). As imagens de ConA e ConBr acopladas à fluoresceína demonstraram que ConA é internalizada e promove apoptose, enquanto ConBr interage com a membrana da célula e não exerce esse efeito. Além disso, ambas proteínas diminuíram os processos histopatológicos, inflamatórios, bioquímicos e nociceptivos causados pela administração de Etanol/POA em camundongos. Estes dados em conjunto reforçam o papel dessas lectinas como potenciais moléculas para investigações de tratamento no curso da pancreatite aguda alcoólica.
Abstract: Ethanol/POA causes calcium elevations, mitochondrial collapse, necrosis of pancreatic acinar cells and acute experimental pancreatitis, It is one of the best models characterized for the study of acute alcoholic pancreatitis, which until now has no cure or effective treatment. In this sense, the ConA and ConBr lectins have important biological activities of cellular and systemic protection in several disease models, and, therefore, present themselves as a potential therapeutic alternative. The objective of this study was to evaluate the effect of ConA and ConBr on in vitro and in vivo pancreatic injury caused by Ethanol/POA. Acinar cells were isolated from pancreas of male Swiss mice and human, incubated with ConA or ConBr (10 μg/ml, 1h), followed by incubation with Ethanol/POA (100 μM, 30 min). In order to analyze the calcium channel participation, tapsigargine (2 μM, Ca2+ pump of the Endoplasmic Reticulum-SERCA) was used. In order to evaluate the lectin domain, the lectins were incubated for 1 h with α-methyl-mannoside (α-MM; 0.1M). The analyzes were carried out using fluorophores and evaluated by confocal microscope or fluorimeter. ConA or ConBr coupled to fluorescein were used to evaluate their interaction with the acinar cell. Data expressed as mean ± standard error of the mean and considered statistical when p <0.05. The necrosis caused by Ethanol/POA (24.9 ± 2.6%) in murine acinar cells, compared to control (9.0 ± 2.6%), was prevented (p<0,05) by ConA (8.1 ± 1.3%) and ConBr (9.4 ± 0.8%). This protective effect was abolished by α-MM (ConA: 19.1 ± 3.5 and ConBr: 26.9 ± 6.4%). In human acinar cells ConA (64.21 ± 7.82%) and ConBr (61.70 ± 4.70%) also prevented necrosis caused by Ethanol/POA (84.37 ± 3.45%). The increase of [Ca2+]c caused by Ethanol/POA (488.3 ± 25.07AUC), compared to control (203.3 ± 1.2 AUC), was prevented by ConA (304.7 ± 12.79 AUC) and ConBr (262.6 ± 15.42 AUC). In the evaluation of stock-operated Ca2+ channels (SOCs), the increase of [Ca2+]c levels (2090 ± 139.5 AUC) promoted by administration of 10 mM Ca2+ in cells pre-incubated with TPG, compared to control (190, 3 ± 2.8 AUC), was decreased by ConA (1395 ± 104.6 AUC) and ConBr (1132 ± 131.2 AUC). The increase of [Ca2+]c caused by interaction of Ethanol/POA with inositol triphosphate (IP3R) receptors (413.4 ± 28.30 vs Control: 193.3 ± 2.8 AUC) was decreased by ConA and ConBr (220.8 ± 08.03 e 232.0 ± 20.52 AUC, respectively). The increase of [Ca2+]mit promoted by Ethanol/POA (1248 ± 105.2 AUC), compared to control (189.4 ± 3.7), was reversed by ConA and ConBr (444.8 ± 22.86 e 440.3 ± 67.82 AUC, respectively). However, lectins did not prevent the entry of calcium into isolated mitochondria in MPTP analysis (POA: 0.32 ± 0.06 vs ConA: 0.31 ± 0.05 and ConBr: 0.32 ± 0.06). In addition, the amylase release caused by Ethanol/POA (18.7 ± 2.2) was prevented by ConA and ConBr (13.41 ± 1.1 and 13.25 ± 1.1, respectively). ConA and ConBr images coupled to fluorescein demonstrated that ConA is internalized and promotes apoptosis, whereas ConBr interacts with the cell membrane and does not exert this effect. In addition, the histopathological, inflammatory, biochemical and nociceptive processes caused by the administration of Ethanol/POA in mice were decreased by both lectins. These data together reinforce the role of these proteins as potential molecules for investigations of treatment in the course of acute alcoholic pancreatitis.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/39999
metadata.dc.type: Tese
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