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Title in Portuguese: Efeito antichagásico de peptídeos derivados da hemocianina do camarão Penaeus monodon
Title: Antichagasic effect of peptide derived from shrimp hemocyanin Penaeus monodon
Author: Monteiro, Marília Lopes
Advisor(s): Martins, Alice Maria Costa
Keywords: Doença de Chagas
Trypanosoma cruzi
Hemocianinas
Penaeidae
Issue Date: 29-Jan-2019
Citation: MONTEIRO, M. L. Efeito antichagásico de peptídeos derivados da hemocianina do camarão Penaeus monodon. 2019. 107 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2019.
Abstract in Portuguese: A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é responsável pela infecção de milhões de pessoas em cerca de 21 países, e responsável pelo maior número de óbitos entre as doenças parasitárias. Apesar de possuir grandes impactos sociais e econômicos no Brasil o único medicamento utilizado para o tratamento é o benzonidazol, este possui uma eficácia limitada e alta toxicidade. O presente trabalho tem como objetivo investigar a atividade antichagásica de fragmentos derivados da hemocianina do camarão Penaeus monodon com potencial antimicrobiano (Hmc666-678, Hmc364-382, Hmc185-197 e Hmc476-498), bem como investigar sua seletividade e mecanismo de ação. A citotoxicidade dos peptideos foi avaliada em células LLC-MK2 pelo método do MTT. Foi observado efeito citotóxico a partir da concentração de 50μM. Posteriormente, foi investigado o efeito dos peptídeos sobre as formas epimastigotas nos tempos de 24, 48 e 72 horas por contagem em câmara de Neubauer, encontrando para Hmc666-678 IC50/24h = 4,01μM; IC50/48h = 4,86 μM; IC50/72h = 8,83 μM, para Hmc364-382 IC50/24h = 4,79μM; IC50/48h = 4,5 μM; IC50/72h = 11,27 μM, para Hmc185-197 IC50/24h = 34,14μM; IC50/48h = 86,06 μM; IC50/72h = 90,86 μM e para Hmc476-498 IC50/24h = 24,22μM; IC50/48h = 25,63 μM; IC50/72h = 22,13 μM. Em tripomastigotas o efeito foi avaliado no tempo de 24 horas por contagem em câmara de Neubauer, onde Hmc666-678, Hmc364-382 possuem efeito inibitório em quase todas as concentrações testadas de maneira semelhante,.Foi estimado índice de seletividade (IS), onde o peptídeo Hmc364-382 possui o lS acima de 55,24, Hmc666-678 possui o lS acima de 45,35, Hmc476-498 possui o lS 1,99 e Hmc185-197 lS de 1,27. Baseado no índice de seletividade os Hmc666-678, Hmc364-382 foram selecionados para os ensaios posteriores. Também foi encontrado efeito contra formas amastigota após 24 horas de incubação para ambos os peptídeos nas concentrações IC50, IC50/2 e 2xIC50 e não foi observado uma redução no percentual de células infectadas. Na busca sobre o mecanismo de ação dos peptideos selecionados as alterações ultraestruturais foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) após 24 horas de incubação e de transmissão (MET) após 12 de incubação. Efeitos sobre a integridade da membrana plasmática (marcação por 7-aminoactinomycin D), externalizacao de fosfatidilserina (marcação por AX), espécies reativas de oxigênio (marcação pela forma oxidada de 2’-7’-diclorofluoresceína) e potencial transmembrânico mitocondrial (marcação por rodamina 123) foram avaliados através citometria de fluxo. Os resultados de MET indicam indícios autofágicos, enquanto que MEV e a citometria indicam necrose e apoptose tardia. Sugerindo um inicio autofágico e progressão para apoptose e necrose. Os resultados foram expressos em média ± E.P.M e analisados utilizando ANOVA com Bonferroni’s post-test no programa GraphPad Prism 5. Em conclusão, os quatro peptideos avaliados mostraram potencial antichagasico e Hmc666-678, Hmc364-382 apresentam efeito promissor, com efeito sobre todas as formas evolutivas de T. cruzi e IS acima de 45 com envolvimento de necrose, autofagia e apoptose em seu mecanismo de ação.
Abstract: Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is responsible for the infection of millions of people in about 21 countries, responsible for the highest number of deaths among parasitic diseases. Although it has major social and economic impacts in Brazil, the only drug used for treatment is benzonidazole, which has limited efficacy and high toxicity. The aim of the present work is to investigate the antihagasic activity of hemicyanin-derived fragments of Penaeus monodon shrimp with antimicrobial potential (Hmc666-678, Hmc364-382, Hmc185-197 and Hmc476-498), as well as to investigate their selectivity and mechanism of action. Cytotoxicity of the peptides was evaluated in LLC-MK2 cells by the MTT method. A cytotoxic effect was observed from the 50μM concentration. Subsequently, the effect of the peptides on the epimastigote forms was investigated at 24, 48 and 72 hours by counting in a Neubauer chamber, finding for Hmc666-678 IC50 / 24h = 4.01μM; IC50 / 48h = 4.86 μM; IC50 / 72h = 8.83 μM, for Hmc364-382 IC50 / 24h = 4.79μM; IC50 / 48h = 4.5 μM; IC50 / 72h = 11.27 μM, for Hmc185-197 IC50 / 24h = 34.14μM; IC50 / 48h = 86.06 μM; IC50 / 72h = 90.86 μM and for Hmc476-498 IC50 / 24h = 24.22 μM; IC50 / 48h = 25.63 μM; IC50 / 72h = 22.13 μM. In trypomastigotes the effect was evaluated at the time of 24 hours by counting in Neubauer chamber, where Hmc666-678, Hmc364-382 have inhibitory effect at almost all concentrations tested in a similar manner. It was estimated the selectivity index (IS), where the peptide Hmc364-382 has lS above 55.24, Hmc666-678 has lS above 45.35, Hmc476-498 has lS 1.99 and Hmc185-197 lS of 1.27. Based on the selectivity index the Hmc666-678, Hmc364-382 were selected for the later trials. Effect against amastigote forms was also found after 24 hours of incubation for both peptides at the IC 50, IC50 / 2 and 2xIC50 concentrations and no reduction in the percentage of infected cells was observed. In the search for the mechanism of action of the selected peptides the ultrastructural changes were analyzed by scanning electron microscopy (SEM) after 24 hours of incubation and transmission (TEM) after 12 incubation. Effects on plasma membrane integrity (7-aminoactinomycin D labeling), externalization of phosphatidylserine (AX labeling), reactive oxygen species (oxidized 2'-7'-dichlorofluorescein labeling) and mitochondrial transmembrane potential rhodamine 123) were evaluated by flow cytometry. The results of MET indicate autophagic signs, whereas SEM and cytometry indicate necrosis and late apoptosis. Suggesting an autophagic onset and progression to apoptosis and necrosis. The results were expressed as mean ± SEM and analyzed using ANOVA with Bonferroni's post-test in the program GraphPad Prism 5. In conclusion, the four evaluated peptides showed anti-hagasic potential and Hmc666-678, Hmc364-382 present promising effect, with effect on all the evolutionary forms of T. cruzi and IS above 45 with involvement of necrosis, autophagy and apoptosis in its mechanism of action
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/39878
metadata.dc.type: Dissertação
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