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Title in Portuguese: Identificação e caracterização de duas germinas-like do látex de Calotropis procera
Title: Identification and characterization of two germin-like proteins in the Calotropis procera latex
Author: Freitas, Deborah Carvalho
Advisor(s): Freitas, Cleverson Diniz Teixeira de
Keywords: Germinas
Látex
Oxalato oxidase
Issue Date: 2017
Citation: FREITAS, Deborah Carvalho. Identificação e caracterização de duas germinas-like do látex de Calotropis procera. 2017. 117 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
Abstract in Portuguese: As condições de estresse causadas por fatores bióticos e abióticos, aos quais as plantas estão constantemente expostas, induzem mecanismos de defesa que promovem a produção de PR-proteínas. Neste estudo foram investigadas proteínas germinas e germinas-like (GLPs) pertencentes às famílias PR-15 e PR-16, respectivamente, no látex de C. procera. As buscas no transcriptoma desta espécie revelaram duas sequências com alta similaridade (maior que 60%) com GLPs, que foram nomeadas de GLCp1 e GLCp2. Análises in silico mostraram que as GLPs de C. procera apresentam, consecutivamente, 216 e 206 resíduos de aminoácidos, com massa molecular aparente de 22,79 e 21,79 kDa, valores esses semelhantes aos relatados para germinas-like. A modelagem por homologia gerou modelos confiáveis que ao serem submetidos a estudos de docking molecular evidenciaram um provável sítio de ligação ao oxalato, envolvendo três resíduos de histidina e um de glutamato. O látex de C. procera foi fracionado por métodos cromatográficos e os sete picos obtidos (P1-P7) foram sujeitos a análises proteômicas. Ensaios enzimáticos para detecção de atividade oxalato oxidase (OxO) apresentaram atividade na fração P4. A eletroforese dos picos mostrou que P4 possui proteínas de massa molecular entre 20-25 kDa, possivelmente monômeros de GLP. Os imunoensaios utilizando um peptídeo sintetizado a partir das sequências GLCp1 e GLCp2 foram capazes de reconhecer P4. O ensaio de ELISA também foi realizado com material vegetal sem látex contendo plântulas, raízes das plântulas, sementes não germinadas sem cascas e não germinadas com e sem embrião exposto; em nenhum destes materiais houve reconhecimento pelo anitcorpo anti-GLCP-pep, o que sugere a presença de germinas-like exclusivamente no látex da planta. A grande identidade com GLPs indicam que as duas sequências de C. procera são germinas-like. De acordo com os ensaios enzimáticos as mesmas possuem atividade oxalato oxidase, uma atividade incomum em GLPs, sendo, portanto, o primeiro relato de germinas-like com atividade OxO em fluidos laticíferos.
Abstract: The constant exposure of plants to stress conditions caused by biotic and abiotic factors induces defense mechanisms that promote the production of PR-proteins. In this study, the germin and germin-like proteins (GLPs) belonging to the PR-15 and PR-16 families, respectively, were investigated in latex of C. procera. The transcriptome analysis of this species revealed two sequences with high similarity (greater than 60%) with GLPs, which were named GLCp1 and GLCp2. In silico analysis showed that the GLPs of C. procera consecutively presented 216 and 206 amino acid residues, with apparent molecular weight of 22.79 and 21.79 kDa, values similar to those reported for germin-like. Homology modeling generated reliable models that after undergoing molecular docking studies evidenced a probable oxalate binding site involving three histidine and one glutamate residues. The latex of C. procera was fractionated by chromatographic methods and the seven peaks obtained (P1-P7) were subjected to proteomic analysis. Enzymatic assays detected oxalate oxidase (OxO) activity in the P4 fraction. An electrophoresis of the peaks showed that P4 has proteins of molecular weight between 20-25 kDa, possibly monomers of GLP. Immunoassays using a peptide synthesized from the GLCp1 and GLCp2 sequences were able to recognize P4. The ELISA assay was also performed with latex-free plant material containing seedlings, seedling roots, non-germinated bark-free seeds and non-germinated seeds with and without exposed embryos, in all these latex-free materials there was no recognition by the anti-GLCp-pep antibody, suggesting that these proteins are only found in the latex. The large GLP identity indicates that the two C. procera sequences are germin-like proteins. According to the enzymatic assays they have oxalate oxidase activity, an unusual activity in GLPs, being, therefore, the first report of germin-like proteins with OxO activity in laticifers fluids.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/37470
metadata.dc.type: Dissertação
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