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Title in Portuguese: Abordagens cromatográficas para purificação da proteína NS1 nativa do virus da dengue sorotipo II (DENV-2)
Author: Estrázulas, Tiago Severo
Advisor(s): Silva Júnior, Ivanildo José da
Co-advisor(s): Van Tilburg, Mauricio Fraga
Gondim, Diego Romão
Keywords: Engenharia química
Proteínas - Purificação
Cromatografia
Adsorção
Troca iônica
Protein purification
Ion exchange
Affinity chromatography
Adsorption chromatographic profile
Issue Date: 2018
Citation: ESTRÁZULAS, Tiago Severo. Abordagens cromatográficas para purificação da proteína NS1 nativa do virus da dengue sorotipo II (DENV-2). 2018. 104 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química)-Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.
Abstract in Portuguese: O vírus Dengue (DENV) é um arbovírus, da família Flaviviridae e apresenta quatro sorotipos virais, diferentes, tais como, DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. O vírus codifica sete proteínas não estruturais, responsáveis pela replicação do vírus dentro do hospedeiro. Dentre elas, a proteína não estrutural (NS1), possui importância quanto ao diagnóstico precoce da infecção do vírus no organismo de pacientes infectados, uma vez que, esta circula em níveis elevados no sangue durante a fase aguda da doença. O DENV é responsável por uma variedade de manifestações clínicas em diversas partes do mundo e na atualidade infectou em torno de 100 milhões de pessoas. Entretanto, são encontrados vários obstáculos sobre a identificação correta dos sintomas do vírus e seu diagnóstico precoce. Assim, o presente trabalho buscou obter uma alta pureza na forma nativa do vírus através de um protocolo cromatográfico para purificação da proteína não estrutural NS1 nativa do vírus da Dengue sorotipo II oriundas de meio de cultivo de células infectadas (Células Vero). Ao todo foram produzidos sete meios de cultura, com volumes e concentrações diferentes. Devido a baixa concentração inicial dessas amostras, foram realizadas etapas de concentração da amostra, com filtração em membranas e liofilização. Para estudos de purificação da proteína NS1, foram utilizadas técnicas cromatográficas de troca iônica, com coluna Hitrap QFF e cromatografia de afinidade com coluna Hitrap Concanavalina A e corante Procion Red MX-5B imobilizado a matriz de Quitosana Alginato Epoxidado (QAE), atuando como matriz de afinidade pseudobioespecífica. O melhor perfil de adsorção da NS1 foi obtido com o uso de colunas de afinidade, devido sua maior especificidade com a proteína de interesse e os ensaios realizados com a coluna Hitrap Concanavalina A e com o corante PR-MX5B-QAE, apresentaram uma maior retenção da NS1, com remoção parcial de proteínas presentes na amostra bruta inicial. Estudos realizados com cromatografia de troca iônica, para adsorção desta proteína, identificaram os melhores resultados de adsorção nos ensaios com a amostra A2 de NS1-DENV2, em Gradiente degrau 35 min (presença de 6 amostras contendo a NS1 na etapa de eluição – cerca de 50% das amostras eluídas da coluna) e linear 30 min (presença de 5 amostras contendo a NS1 – cerca de 40% das amostras eluídas). Entretanto, as condições utilizadas favoreceram a adsorção de praticamente todas as proteínas presentes na amostra inicial, como por exemplo, a albumina.
Abstract: Dengue virus (DENV) is an arbovirus of the Flaviviridae family and has four different viral serotypes, such as DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. The virus codes for seven non-structural proteins responsible for virus replication within the host. Among them, the nonstructural protein (NS1), is important in the early diagnosis of virus infection in the body of infected patients, since it circulates in high blood levels during the acute phase of the disease. DENV is responsible for a variety of clinical manifestations in various parts of the world and currently infects around 100 million people. However, several obstacles are encountered regarding the correct identification of virus symptoms and their early diagnosis. Thus, the present work sought to obtain a high purity in the native form of the virus through a chromatographic protocol for purification of the NS1 nonstructural protein native to the Dengue serotype II virus originating from the culture medium of infected cells (Vero cells). In all, seven culture media were produced, with different volumes and concentrations. Due to the low initial concentration of these samples, sample concentration steps were carried out with membrane filtration and lyophilization. For NS1 purification studies, ion exchange chromatography techniques were used, with Hitrap QFF column and Hitrap Concanavalin A column affinity chromatography and Procion Red MX-5B dye immobilized the Chitosan Alginate Epoxidate (QAE) matrix, acting as matrix of pseudobiospecific affinity. The best adsorption profile of NS1 was obtained with the use of affinity columns, due to their higher specificity with the protein of interest and the tests performed with the Hitrap Concanavalin A column and the PR-MX5B-QAE dye showed a higher retention of NS1, with partial removal of proteins present in the initial crude sample. For the adsorption of this protein, the best adsorption results were found in the NS1-DENV2 A2 sample, in the gradient gradient 35 min (presence of 6 samples containing the NS1 in the elution step - about 50% of samples eluted from the column) and linear 30 min (presence of 5 samples containing NS1 - about 40% of the samples eluted). However, the conditions favored the adsorption of almost all the proteins present in the initial sample, such as albumin.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/36832
metadata.dc.type: Dissertação
Appears in Collections:DEQ - Dissertações defendidas na UFC

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