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Title in Portuguese: Potencial antibacteriano e tripanocida da proteína recombinante rCV2736 de Chromobacterium violaceum produzida em células de Pichia pastoris
Title: Antibacterial and trypanocidal potential of the recombinant rCV2736 protein of Chromobacterium violaceum produced in Pichia pastoris cells
Author: Medeiros, Suelen Carneiro de
Advisor(s): Nogueira, Nádia Accioly Pinto
Co-advisor(s): Grangeiro, Thalles Barbosa
Keywords: Quitina
Petidoglicano
Imunidade Heteróloga
Issue Date: 2018
Citation: MEDEIROS, S. C. Potencial antibacteriano e tripanocida da proteína recombinante rCV2736 de Chromobacterium violaceum produzida em células de Pichia pastoris. 2018.. 124 f. Tese (Doutorado em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018.
Abstract in Portuguese: O uso indiscriminado de antimicrobianos tem levado ao surgimento de microrganismos apresentando resistência a antibióticos. O estudo de genes de vários organismos se tornou uma alternativa no desenvolvimento de novos fármacos. Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativo, apresentando ORFs (Open Reading Frame) que codificam para proteínas de uso biotecnológico. rCV2736 é uma Chitinase-like recombinante, produzida em Pichia pastoris KM71H, que apresentou baixa atividade quitinolítica, porém com atividade antibacteriana. Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial da proteína recombinante de C. violaceum ATCC 12472, rCV2736, como um antimicrobiano, bem como determinar seu mecanismo de ação. Para isso, a proteína recombinante foi purificada por cromatografia hidrofóbica e caracterizada por sequenciamento N-terminal, deglicosilação, espectrometria de massas, atividade quitinásica e peptidoglicano hidrolase. Atividade biológica foi avaliada através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e Concentração bactericida mínima (CBM) por microdiluição em caldo, efeito do tempo de exposição na viabilidade bacteriana, efeito da alteração do pH na atividade antimicrobiana, efeito modulador na atividade de antimicrobianos de uso clínico, atividade antibiofilme, atividade antiparasitária, hemotoxicidade e simulação por Docking molecular. rCV2736 apresentou 3 isoformas após purificação. A sequencia N-terminal da proteína correspondente a banda com 42 kDa apresentou 33 aminoácidos, dentre eles os resíduos adicionados pelo vetor de expressão. Bandas com massas moleculares aparentes de 35.682 Da e 34.988 Da, foram visualizadas devido à deglicosilação pela enzima N-glicosidase F. A espectrometria de massas revelou peptídeos correspondendo a porção C e N-terminal, e O e N-glicosilações. A atividade quitinásica aumentou (137,5 U) com maior tempo de incubação (24 h), com quitina coloidal. Avaliando a presença de NaCl na amostra, não houve diferença entre as concentrações testadas. A interação com Ba2+, Ni2+ e Fe3+ causou diminuição da atividade relativa acima de 50%. Na atividade peptidoglicano hidrolase, foram visualizadas bandas compatíveis com lise celular com massa molecular aparente referente a rCV2736. rCV2736 inibiu o crescimento de todas as cepas testadas, sendo bactericida para Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e Klebsiella pneumonia ATCC 10031 (365 μg/mL). Esta mesma concentração inviabilizou o crescimento dessas cepas após 4h e 8 h, respectivamente. O aumento do pH do meio de cultura reduziu o potencial antibacteriano da rCV2736 para as bactérias citadas. O efeito sinérgico foi constatado para associações com ceftazidima, tetraciclina e amicacina. rCV2736 foi capaz de inibir a formação de biofilme de P. aeruginosa e K. pneumoniae nas concentrações acima de 182,5 μg/mL, porém redução no número de UFC/ml foi observada para as concentrações usadas sobre o biofilme formado. rCV2736 apresentou IC50 de 1089 μg/mL nos ensaios utilizando epimastigotas, e 118,3 μg/mL para tripomastigotas. rCV2736 não se apresentou hemotóxica. Nas simulações de docking molecular foi possível observar que os dois ligantes [(GlicNac)4 e (GlcNAc- MurNAc)2] interagiram de forma favorável na fenda catalítica predita, onde visualizou-se interação entre o resíduo responsável pela catálise (Glu110) e o átomo de oxigênio da ligação glicosídica. Portanto, rCV2736 pode ser considerada como uma molécula com potencial antibacteriano e antiparasitário, onde seu possível mecanismo de ação antibacteriano pode ser explicado pelo efeito enzimático sobre a molécula do peptidoglicano.
Abstract: The indiscriminate use of antimicrobials has led to the emergence of microorganisms presenting resistance to antibiotics. The study of genes from various organisms has become an alternative in the development of new drugs. Chromobacterium violaceum is a Gram-negative bacterium, presenting ORFs (Open Reading Frame) that code for proteins of biotechnological use. rCV2736 is a recombinant Chitinase-like, produced in Pichia pastoris KM71H, which presented low chitinolytic activity, but with antibacterial activity. This work aimed to evaluate the potential of the recombinant protein of C. violaceum ATCC 12472, rCV2736, as an antimicrobial, as well as to determine its mechanism of action. For this, the recombinant protein was purified by hydrophobic chromatography and characterized by N-terminal sequencing, deglicosylation, mass spectrometry, chitinase activity and peptidoglycan hydrolase. Biological activity was evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and Minimum bactericidal concentration (MBC) by microdilution in broth, effect of exposure time on bacterial viability, effect of pH change on antimicrobial activity, modulating effect on antimicrobial activity of clinical use, antibiofilm activity, antiparasitic activity, hemotoxicity and simulation by molecular docking. rCV2736 showed 3 isoforms after purification. The Nterminal sequence of the protein corresponding to the 42 kDa band presented 33 amino acids, among them residues added by the expression vector. Bands with apparent molecular weights of 35,682 Da and 34,988 Da were visualized due to deglicosylation by the enzyme Nglycosidase F. Mass spectrometry revealed peptides corresponding to the C and N-terminal portion, and O and N-glycosylations. Chitinase activity increased with longer incubation time (24 h) with colloidal chitin (137,5 U). Evaluating the presence of NaCl in the sample, there was no difference between the concentrations tested. The interaction with Ba2+, Ni2+ and Fe3+ caused a decrease in relative activity above 50%. In the peptidoglycan hydrolase activity, bands related to cell lysis with apparent molecular weight relative to rCV2736 were visualized. rCV2736 inhibited the growth of all strains tested, being bactericidal for Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 and Klebsiella pneumonia ATCC 10031 (365 μg/ml). This same concentration prevented the growth of these strains after 4 h and 8 h, respectively. Increasing the pH of the culture medium reduced the antibacterial potential of rCV2736 for the above bacteria. The synergistic effect was observed for combinations with ceftazidime, tetracycline and amikacin. rCV2736 was able to inhibit the formation of P. aeruginosa and K. pneumoniae biofilms at concentrations above 182.5 μg/mL, but a reduction in the number of CFU/mL was observed for the concentrations used on the biofilm formed. rCV2736 showed IC50 of 1089 μg/mL in the assays using epimastigotes, and 118.3 μg/mL for trypomastigotes. rCV2736 did not present haemotoxic effects. In the molecular docking simulations, it was possible to observe that the two ligands [(GlicNac)4 and (GlcNAc-MurNAc)2] interacted favorably in the predicted catalytic cleft, where interaction between the residue responsible for catalysis (Glu110) and oxygen atom of the glycosidic bond. Therefore, rCV2736 can be considered as a molecule with antibacterial and antiparasitic potential, where its possible mechanism of antibacterial action can be explained by the enzymatic effect on the peptidoglycan molecule.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/34449
metadata.dc.type: Tese
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