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Title in Portuguese: Análise da virulência, sensibilidade antifúngica e mecanismos de resistência a azólicos em cepas de Candida tropicalis de origem humana e veterinária
Title: Analysis of virulence, antifungal sensitivity and mechanisms of resistance to azoles in strains of Candida tropicalis of human and veterinary origin
Author: Oliveira, Jonathas Sales de
Advisor(s): Rocha, Marcos Fábio Gadelha
Co-advisor(s): Brilhante, Raimunda Sâmia Nogueira
Keywords: Candida tropicalis
Fatores de Virulência
Biofilmes
Issue Date: 7-Nov-2017
Citation: OLIVEIRA, J. S. Análise da virulência, sensibilidade antifúngica e mecanismos de resistência a azólicos em cepas de Candida tropicalis de origem humana e veterinária. 2017. 156 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017.
Abstract in Portuguese: Candida tropicalis, uma levedura comensal presente na microbiota de homens e outros animais, é uma das principais espécies de Candida associadas a infecções invasivas graves em humanos, podendo também causar infecções em outros animais. O presente estudo objetivou analisar fatores de virulência, perfil de sensibilidade e mecanismos de resistência a azólicos em cepas de C. tropicalis de origem humana (n = 24) e veterinária (n = 28), bem como avaliar o efeito da prometazina sobre células de C. tropicalis resistentes a derivados azólicos. Na primeira parte da pesquisa, foi avaliada a produção in vitro de fosfolipase e protease, atividade hemolítica, produção de biofilme e infecção experimental utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans, além de avaliar a sensibilidade de células planctônicas e sésseis frente aos antifúngicos fluconazol, itraconazol, voriconazol, caspofungina e anfotericina B. Na segunda parte, foram avaliados a quantidade de esteróis totais, o efluxo de rodamina 6G e a expressão dos genes CDR1, MDR1 e ERG11 em cepas de origem humana (n = 13) e veterinária (n = 13). Por fim, na terceira parte, a sensibilidade de células planctônicas e sésseis frente à prometazina sozinha e em combinação com antifúngicos foi analisada utilizando 2 cepas resistentes a azólicos e uma cepa sensível de C. tropicalis. A atividade antifúngica da prometazina foi investigada através da curva de tempo de morte e observando o efeito da droga sobre o efluxo da rodamina 6G, tamanho/granulosidade celular, integridade de membrana e potencial transmembrana mitocondrial, utilizando citometria de fluxo. Quanto à produção de fatores de virulência, in vitro, 21,15% das cepas apresentaram a produção de fosfolipase, 44,23% produziram protease e 96% foram positivos para a atividade hemolítica. Quanto à produção de biofilme, 98% das cepas foram capazes de produzir essa formação fúngica, a maioria mostrando forte produção (65,38%). Altas taxas de mortalidade de C. elegans foram observadas quando os vermes foram expostos a cepas de C. tropicalis, atingindo 96% de nematódeos mortos após 96 h da exposição. No tocante à sensibilidade antifúngica, 10 cepas foram resistentes a pelo menos 1 azólico, sendo que 5 cepas foram resistentes a todos os azólicos testados. Caspofungina e anfotericina B apresentaram os melhores resultados de inibição frente ao biofilme maduro de C. tropicalis quando comparados com os derivados azólicos. Efeito paradoxal no biofilme foi observado em concentrações elevadas de caspofungina (8-64 µg/mL). Em relação ao estudo dos mecanismos de resistência a azólicos, não foi observado diferença entre os conteúdos de esteróis totais das cepas testadas, porém foi observado que 6 cepas não-sensíveis ao fluconazol apresentaram aumento do efluxo de rodamina 6G. Cepas não-sensíveis e pouco-sensíveis ao fluconazol apresentaram uma média de expressão para os genes CDR1, MDR1 e ERG11 maior que as cepas sensíveis, sendo que 2 cepas não-sensíveis apresentaram expressão elevada para todos os três genes. A prometazina inibiu as células planctônicas e sésseis nas concentrações 64 e 128 µg/mL, respectivamente. A adição de concentração sub-inibitórias de prometazina reduziu as CIMs dos azólicos testados para as cepas resistentes, alterando o fenótipo de resistência. Pré-incubação com prometazina reduziu o efluxo de rodamina 6G, além de causar alteração no tamanho/granulosidade celular, dano na membrana plasmática e despolarização da membrana mitocondrial. O presente trabalho mostrou que cepas humanas e veterinárias de C. tropicalis apresentam similar produção de fatores de virulência e patogenicidade. Além disso, a resistência a azólicos em cepas veterinárias está relacionada, em parte, à expressão elevada do gene ERG11 e de bombas de efluxo. Por fim, prometazina apresenta sinergismo com azólicos frente a cepas resistentes de C. tropicalis, causando danos na membrana celular e atividade mitocondrial da célula fúngica.
Abstract: Candida tropicalis, an yeast isolated as comensal from humans and other animals, is a major Candida species associated with serious invasive infections in humans, being also able to cause infection in several animal species. The present study aimed to analyze virulence factors, the susceptibility profile and mechanisms of resistance to azoles in human (n = 24) and veterinary (n = 28) isolates of C. tropicalis, as well as to evaluate the effect of promethazine on cells of C. tropicalis isolates resistant to azoles. In the first part of this research, the in vitro production of phospholipases and proteases, hemolytic activity, biofilm production and experimental infection using the nematode Caenorhabditis elegans was evaluated, as well as the susceptibility of planktonic and sessile cells against the antifungals fluconazole, itraconazole, voriconazole, caspofungin and amphotericin B. Total sterols content, efflux of rhodamine 6G and expression levels of CDR1, MDR1 and ERG11 genes in human (n = 13) and veterinary (n = 13) isolates were also assessed. Finally, the susceptibility of planktonic and sessile cells to promethazine alone and in combination with antifungals was analyzed using 2 strains resistant to azoles and a sensitive strain of C. tropicalis. Antifungal activity of promethazine was investigated through the time-kill curve and assessing the effects of the drug on the efflux of 6G rhodamine, cell size/granularity, membrane integrity and mitochondrial transmembrane potential, through flow cytometry. Regarding the in vitro production of virulence factors, 21.15% of the strains showed phospholipase production, 44.23% produced protease and 96% were positive for hemolytic activity. 98% of the strains were able to produce biofilm, most showing strong production (65.38%). High mortality rates of C. elegans were observed when worms were exposed to C. tropicalis strains, reaching 96% of death after 96 h of exposure to the strains. Concerning the antifungal susceptibility profile, 10 isolates were resistant to at least 1 azole and 5 isolates were resistant to all azoles tested. Caspofungin and amphotericin B showed the best inhibition results against C. tropicalis mature biofilm when compared to the azole antifungals. Paradoxical effect on mature biofilm was observed at high concentrations of caspofungin (8-64 μg/mL). Regarding the study of mechanisms of azole resistance, no difference was observed between total sterols contents of the groups analyzed, however, 6 fluconazole-non-susceptible isolates showed increased efflux of 6G rhodamine. Fluconazole-non-susceptible and fluconazole-less-susceptible isolates showed a mean expression for CDR1, MDR1 and ERG11 genes greater than the susceptible isolates, with 2 fluconazole-non-susceptible isolates showing high expression for all three genes. Promethazine showed inhibition of planktonic and sessile cells at concentrations of 64 and 128 μg/mL, respectively. The addition of sub-inhibitory concentrations of promethazine reduced the MIC of the azoles tested against the resistant strains, altering the resistance phenotype. Pre-incubation with promethazine reduced the efflux of 6G rhodamine, in addition to causing changes in cell size/granularity, plasma membrane damage and mitochondrial membrane depolarization. The present work showed that human and veterinary isolates of C. tropicalis presented similar production of virulence factors and pathogenicity. In addition, azole resistance in veterinary C. tropicalis strains is related, in part, to elevated ERG11 gene expression and efflux pump activity. Finally, promethazine shows synergism with azoles against resistant strains of C. tropicalis, causing cell membrane and mitochondrial activity impairment on fungal cells.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/29778
metadata.dc.type: Tese
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