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Title in Portuguese: Diagnóstico microbiológico, imunoenzimático e molecular e perfil de genes associados à virulência de Campylobacter
Author: Quetz, Josiane da Silva
Advisor(s): Lima, Aldo Ângelo Moreira
Keywords: Diarreia Infantil
Campylobacter
Virulência
Issue Date: 2013
Citation: QUETZ, Josiane da Silva. Diagnóstico microbiológico, imunoenzimático e molecular e perfil de genes associados à virulência de Campylobacter. 2013. 166 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013.
Abstract in Portuguese: Campylobacter sp. é uma importante causa de enterite de origem alimentar com alta incidência na população infantil de países em desenvolvimento. No entanto, o diagnóstico específico de sua etiologia segue como um desafio, visto que métodos moleculares e imunoenzimáticos têm se mostrado mais sensíveis. Postulamos que o conhecimento de sua virulência e o diagnóstico específico possam ajudar na identificação e potencial controle da campilobacteriose na infância. Foi determinada a etiologia de diarreia por Campylobacter sp., em um estudo transversal sobre diarreia em crianças de 0-36 meses residentes da área urbana de Fortaleza, Ceará, Brasil, que necessitaram de atendimento médico de urgência por causa de doença diarreica. Após a aprovação ética do estudo, um questionário foi aplicado para qualificar as condições clínicas apresentadas por cada criança no momento da admissão. O DNA foi extraído diretamente de amostras fecais coletadas de 226 crianças. Para a detecção do agente etiológico, utilizamos diagnóstico molecular (PCR e RT-PCR) e diagnóstico imunoenzimático (ELISA), além da detecção de genes associados à virulência de C. jejuni (PCR). Campylobacter sp. foi encontrado em 8,9% (20/225) das amostras, por diagnóstico microbiológico convencional. C. jejuni e C. coli foram detectados em 19,5% (44/226) e 1,3% (3/226) das amostras diarreicas, respectivamente, por PCR. Os diagnósticos por RT-PCR e ELISA alcançaram 26,7% (60/225) e 37,9% (58/153), respectivamente. Quando considerada a combinação de diagnósticos (positividade no diagnóstico microbiológico ou no imunoenzimático e ao menos em um dos testes moleculares) a prevalência encontrada foi de 16,4% (37/226). A concordância entre os testes para diagnóstico utilizados foi de moderada a regular, de acordo com o índice de Kappa. Genes associados à virulência foram detectados nas seguintes proporções de amostras positivas para C. jejuni: flaA, 79,5% (35/44); racR, 97,7% (43/44) e dnaJ, 88,6% (39/44) – relacionados à adesão bacteriana e colonização; ciaB, 97,7% (43/44); pldA, 45,4% (20/44) e pVir 0% (0/44) – relacionados à invasão; e cdtABC em 95,4% (42/44) das amostras, operon relacionado à produção da toxina citoletal distensora (CDT). Sinais e sintomas específicos, tais como sangue nas fezes, vômito, febre e/ou dor abdominal, apesar de bastante frequentes, não foram associados com a detecção de C. jejuni. O perfil de distribuição dos genes de virulência de C. jejuni não apresentou correlação com a apresentação clínica da doença, mesmo quando tal perfil foi categorizado de acordo com a função das proteínas codificadas pelos genes, o que nos leva a crer que outros fatores, talvez relacionados à susceptibilidade do hospedeiro, possam ser mais importantes do que a variabilidade genética do micro-organismo. Concluímos que Campylobacter sp. foi detectado em percentual relevante da população estudada, principalmente quando os métodos diagnósticos foram utilizados de forma combinada. Em geral, os genes de virulência foram detectados em uma alta proporção das amostras positivas para C. jejuni, embora os genes relacionados à invasão tenham sido menos frequentemente encontrados. Corroboramos dados de outros grupos sobre a necessidade de revisão do diagnóstico para Campylobacter sp. em prol da inclusão de metodologias mais sensíveis e espécie-específicas, além da busca por marcadores para inflamação intestinal e fatores preditivos de cultura negativa.
Abstract: Campylobacter sp. is an important cause of food-borne gastroenteritis with high incidence in children living in developing countries. However, the specific diagnosis of its etiology remains as a challenge, since conventional diagnosis by culture is now challenged by molecular and immunoenzymatic methods, which have greater sensitivity. We postulate that the knowledge of its virulence and specific diagnosis may assist in identifying and potentially controling campylobacteriosis in childhood. We determined the etiology of Campylobacter sp. associated diarrhea, in a cross-sectional study of diarrhea in children aged 0-36 months from the urban area of Fortaleza, Ceará, Brazil, who required emergency medical care because of diarrheal disease. After ethical approval of the study, a questionnaire was applied to describe the clinical conditions presented by each child at the time of admission. DNA was extracted directly from fecal samples collected from 226 children. For the determination of the etiologic agent we used molecular diagnostics (PCR and RT-PCR) and diagnostic immunoassay (ELISA), besides the detection of virulence associated genes of C. jejuni (PCR). Campylobacter sp. was found in 8.9% (20/225) of the samples by conventional microbiological diagnosis. C. jejuni and C. coli were detected in 19.5% (44/226) and 1.3% (3/226) of the diarrheic samples, respectively. The diagnostic RT-PCR and ELISA reached 26.7% (60/225) and 37.9% (58/153) of positivity, respectively. When considering the combination of diagnostic (positive in microbiological diagnosis or immunoassay and at least one of the molecular tests) the prevalence was 16.4% (37/226). The agreement between the tests used for diagnosis was moderate to regular, according to Kappa index. The presence of C. jejuni´s virulence-associated genes that encode proteins related to the pathogenesis of micro-organism were detected in the following proportions of C. jejuni-positive DNA samples: flaA, 79.5% (35/44); racR, 97.7% (43/44) and dnaJ, 88.6% (39/44) – related to bacterial adhesion and colonization; ciaB, 97.7 % (43/44); pldA, 45.4% (20/44) and pVir 0% (0/44) – related to invasion, and cdtABC in 95.4% (42/44) of samples related to citoletal distending toxin (CDT). Specific signs and symptoms such as blood in the stool, vomiting, fever and/or abdominal pain, although quite frequent, were not associated with the detection of C. jejuni. The distribution profile of C. jejuni´s virulence genes was not correlated with the clinical presentation of the disease, even when this profile was categorized according to the function of the proteins encoded by the genes, which leads us to believe that other factors, perhaps related to host susceptibility, may be more important than genetic variability of the microorganism. We conclude that Campylobacter sp. was detected in a significant percentage of the children 0-36 months with diarrhea, especially when the diagnostic methods were used in combination. In general, the virulence genes were detected in a high proportion of C. jejuni-positive samples, although the invasion-related genes have been found less frequently. Our data corroborates findings from other groups on the need to revise the diagnostic for Campylobacter sp. towards the inclusion of more sensitive and species-specific methods, as well as search for extra markers for intestinal inflammation and predictors of negative culture.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/15731
metadata.dc.type: Tese
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