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Title in Portuguese: Ação tripanocida de um mastoparano de Polybia paulista e seu possível mecanismo de ação
Title: Trypanocidal action : a mastoparan isolated from Polybia paulista and its possible mechanism action
Author: Vinhote, Juliana Freire Chagas
Advisor(s): Martins, Alice Maria Costa
Keywords: Venenos de Vespas
Antiparasitários
Trypanosoma cruzi
Issue Date: 2015
Citation: VINHOTE, J. F. C. Ação tripanocida de um mastoparano de Polybia paulista e seu possível mecanismo de ação. 2015. 102 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015.
Abstract in Portuguese: A doença de Chagas, considerada uma doença negligenciada, é uma infecção parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi e endêmica em diversos países. No Brasil, apenas o Benzonidazol é usado para o tratamento da doença. Nesse contexto, o potencial terapêutico das toxinas vem cada vez mais conquistando espaço e despertando grandes interesses da comunidade científica. Os venenos de invertebrados têm apresentado grande interesse como fonte de substâncias bioativas. Os mastoparanos, a classe mais amplamente descrita de peptídeos isolados a partir da peçonha de vespas, ja evidenciaram diferentes atividades biológicas. Assim, os peptídeos isolados têm despertado interesse científico como fonte de modelos moleculares para o possível desenvolvimento de novas terapias farmacológicas. Este estudo investigou o efeito do peptideo mastoparano (MP) isolado do veneno da vespa Polybia paulista sobre cepa Y de Trypanosoma cruzi e seu possível mecanismo de ação. Formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas, tratadas com diferentes concentrações de MP e incubadas durante 24, 48 e 72 horas. Formas tripomastigotas de T. cruzi obtidas através de infecção de células LLCMK2 foram subcultivadas, tratadas com diferentes concentrações de MP e incubadas durante 24 horas. Para investigar a participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no efeito citotóxico do mastoparano sobre formas epimastigotas de T.cruzi, placas foram incubadas com a CI50 de 24h de MP e a análise da emissão de fluorescência foi realizada em citometria de fluxo após adição de DCF. O efeito de mastoparano sobre o potencial de membrana mitocontrial das formas epimastigotas foi realizado pelo ensaio com rodamina 123. A citotoxicidade foi avaliada sobre celulas Raw 264.7 e a viabilidade dos macrófagos foi determinada utilizando o ensaio com MTT. No estudo de Docking molecular, obteve-se inicialmente a estrutura tridimensional do mastoparano a partir da sequência primária em programa específico. Após análise dos sítios de ligação entre peptídeo e enzima TcGAPDH, a estrutura cristalográfica do complexo TcGAPDH-chalepina foi utilizada para comparação. O mastoparano inibiu o crescimento das formas epimastigotas de T. cruzi, apresentando uma CI50 de 102 µg/mL, 53,95 µg/mL e 58,51 µg/mL para 24, 48 e 72 horas de incubação respectivamente. Na análise da produção de espécies reativas houve um aumento significativo na intensidade relativa de fluorescência, quando comparado ao grupo controle. O peptideo alterou o potencial da membrana mitocondrial do parasita. Para as formas tripomastigotas a CI50 foi 8,83 µg/mL após 24h de incubação. A citotoxidade do mastoparano avaliada em macrófagos não induziu morte celular significativa nas diferentes concentrações estudadas. No estudo de docking, foi evidenciado o acoplamento do mastoparano na TcGAPDH, demonstrando os diferentes sítios de ligação dos resíduos de aminoácidos do centro ativo da enzima e comparando a semelhança na posição ocupada pela molécula chalepina na TcGAPDH. Conclui-se que o mastoparano apresentou atividade tripanocida envolvendo a participação do estresse oxidativo e alteração do potencial de membrana sem apresentar citotóxica em células de macrófagos e parece inibir a TcGAPDH de T. cruzi. Portanto, o mastoparano se destaca como importante molécula bioativa contra os parasitas.
Abstract: Chagas disease, a neglect ed disease, is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and is endemic in several countries. In Brazil, only benznidazole is used for treating the disease. In this context, the therapeutic potential of toxins is increasingly gaining gro und and stirring interest in the scientific community. The poisons of invertebrates have become intriguing as a source of bioactive substance. The mastoparan, the most widely described class of peptides isolated from the venom of wasps, already shows diffe rent biological activities. Thus, isolated peptides have attracted scientific interest as a source of molecular model for the possible development of new drug therapies. This study investigated the effect of mastoparan peptide (MP) isolated from the venom of a Polybia paulista wasp on the Y strain of T. cruzi and its possible mechanism of action. Epimastigote forms of T. cruzi were grown, treated with various concentrations of MP, and incubated for 24, 48, and 72 hours. Trypomastigote forms of T. cruzi obta ined by LLCMK2 cells infected were subcultured, treated with various concentrations of MP, and incubated for 24 hours. To investigate the involvement of reactive oxygen species (ROS) in the mastoparan cytotoxic effect on T. cruzi epimastigotes, plates were incubated with IC50 of 24 MP; an analysis of fluorescence emission was performed via flow cytometry after adding dichlorofluorescein (DCF). The mastoparan effect on the mitochondrial membrane potential of epimastigotes was tested with rhodamine 123. Cytot oxicity was assessed on RAW 264.7 cells, and the viability of macrophages was determined using the microculture tetrazolium (MTT) assay. In the study of molecular docking, the three dimensional structure of the mastoparan was originally obtained from the p rimary sequence specific program. After analyzing the binding sites of the peptide and T. cruzi glyceraldehyde 3 - phosphate dehydrogenase (TcGAPDH) enzyme, the crystal structure of the TcGAPDH - chalepina complex was used for comparison. The mastoparan inhibi ted the growth of T. cruzi epimastigotes, with an IC50 of 102 μg/ml, 53.95 μg/ml, and 58.51 μg/ml for 24, 48, and 72 hours of incubation, respectively. In the analysis of the ROS generation, there was a significant increase in the relative fluorescence int ensity compared to the control group. The peptide change had the potential of mitochondrial membrane of the parasite. For trypomastigotes, the IC50 was 8.83 μg/ml after 24 hours of incubation. The cytotoxicity of mastoparan evaluated in macrophages did not induce significant cell death in the different concentrations studied. In the docking study, coupling mastoparan was evidenced in TcGAPDH, showing different binding sites residue of the enzyme's active center amino acids and comparing the similar position occupied by the molecule in TcGAPDH - chalepina. It follows that the mastoparan showed trypanocidal activity involving the involvement of oxidative stress and changes in membrane potential without displaying cytotoxic cells; the macrophages seem to inhibit TcGAPDH T. cruzi. Therefore, the mastoparan stands out as an important bioactive molecule against parasites.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/13766
metadata.dc.type: Tese
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