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Title in Portuguese: Efeito antinecrótico das lectinas conA e conBr na lesão de células acinares pancreáticas induzidas por sais biliares, álcool e ácido palmitoléico : envolvimento do domínio letínico
Title: Effect anti-necrotic of ConA and ConBr lectins in pancreatic acinar cell injury induced by bile salt, alcohol, and palmitoleic acid : involvement of the lectin domain
Author: Damasceno, Samara Rodrigues Bonfim
Advisor(s): Soares, Pedro Marcos Gomes
Keywords: Pancreatite Necrosante Aguda
Morte Celular
Lectinas de Plantas
Issue Date: 2015
Citation: DAMASCENO, S. R. B. Efeito antinecrótico das lectinas conA e conBr na lesão de células acinares pancreáticas induzidas por sais biliares, álcool e ácido palmitoléico : envolvimento do domínio letínico. 2015. 111 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2015.
Abstract in Portuguese: A pancreatite aguda é uma doença inflamatória do pâncreas que envolve uma sequência complexa de eventos fisiopatológicos, muitos dos quais ainda desconhecidos. Dados recentes atribuem maior importância aos eventos que aconteceriam no interior da célula pancreática. A gravidade e a duração do estímulo aplicado às células acinares pancreáticas podem levar à apoptose ou à necrose. Um grande número de estudos demonstraram que as lectinas de Canavalia ensiformis (ConA) e Canavalia brasiliensis (ConBr) induzem morte celular por apoptose em diversos tipos de células. Contudo não há estudos sobre seus efeitos anti-necróticos. Dessa forma, investigamos os efeitos de ConA e ConBr frente à morte de células acinares pancreáticas, induzida pelos principais desencadeadores da pancreatite aguda. As células acinares foram isoladas de pâncreas de camundongos Swiss machos. As células foram previamente incubadas durante 1h com ConA (200 µg/ml) e ConBr (200 µg/ml) seguido da indução das lesões celulares pela administração de SATC (500µM), etanol (850mM) ou APO (100 µM) durante 30 min (T.A). Para avaliar a participação do domínio lectínico de ConA e ConBr, as lectinas foram previamente incubadas, durante 1h a 37ºC, com seu açúcar ligante α-metil-manosídeo (α-MM), ou com um açúcar não ligante, D-galactose, ambos na concentração de 0,2M, antes dos protocolos experimentais. Todos os grupos foram incubados por 5 minutos com o marcador nuclear Hoechst 33342 (50 µg/ml) e com o marcador de necrose iodeto de propídeo (IP; 10 µg/ml). Em outra análise, ConA e ConBr conjugadas ao isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram incubadas durante 1h (T.A), com as células acinares. Para a avaliação do efeito de ConA e ConBr no potencial de membrana mitocondrial (ΔѰm) de células acinares pancreáticas sob administração de SATC, etanol ou APO, as células foram marcadas com Hoechst 33342 e tetrametilrodamina-metiléster (TMRM, corante fluorescente que é prontamente sequestrado pela mitocôndria ativa). Todas as análises foram realizadas no microscópio confocal FluoViewTM 1000 – Olympus. Os resultados mostraram que os grupos SATC, etanol e APO causaram necrose significativa às células, quando comparado com os grupos controles e que o pré-tratamento de ConA e ConBr promoveu proteção significativa (p < 0,05) contra a necrose causada pelos três agentes lesivos. Quando as lectinas foram complexadas ao seu açúcar ligante, α-MM, este efeito protetor foi significativamente revertido (p < 0,05); não sendo alterado, porém, pelo açúcar não específico D-galactose, evidenciando a participação do domínio lectínico no seu efeito protetor. As lectinas conjugadas com FITC evidenciaram uma marcação nas células acinares a nível de membrana, confirmando a sua interação com carboidratos presentes na superfície dessas células. Na análise do potencial mitocondrial, SATC, etanol e principalmente APO desencadearam intensa despolarização do ΔѰm das células acinares pancreáticas. O pré-tratamento com ConA preveniu (p < 0,05) a disfunção mitocondrial em todos os modelos de lesão, contudo ConBr preveniu essa disfunção na lesão causada por SATC e etanol (p < 0,05), sem alterar a disfunção causada por APO. Diante do exposto, ConA e ConBr protegem células acinares pancreáticas contra a necrose induzida por ácido taurolitocólico sulfatado, etanol e APO, tendo seus efeitos mediados pelo domínio lectínico, além da manutenção da integridade da membrana mitocondrial da célula pancreática, fator determinante para evitar o curso da necrose na pancreatite aguda.
Abstract: Acute pancreatitis is an inflammatory disease of the pancreas which involves a complex sequence of pathophysiological events, many of which are still unknown. Recent data give more importance to the events that happen within the pancreatic cell. The severity and duration of the stimulus applied to pancreatic acinar cells may lead to apoptosis or necrosis. A large number of studies have demonstrated that the lectin of Canavalia ensiformis (ConA) and Canavalia brasiliensis (ConBr) induce cell death by apoptosis in various cell types. However there are no studies on its anti-necrotic effects. Thus, we investigated the effects of ConA and ConBr concerning the death of pancreatic acinar cells, induced by the main triggers of acute pancreatitis. The acinar cells were isolated from the pancreas of male Swiss mice. The cells were pre-incubated with ConA and ConBr for 1h followed by the induction of cell damage by SATC, ethanol or APO administration for 30 min (room temperature, RT). To evaluate the role of the lectin domain of ConBr and ConA, the lectins were preincubated for 1h at 37°C with its alpha-methyl-mannoside (α-MM) ligand sugar, or with a nonbinding sugar, D-galactose, both at a concentration of 0.2M, prior to experimental protocols. All groups were incubated for 5 minutes with the nuclear marker Hoechst 33342 (50 µg/ml) and with the necrosis marker, propidium iodide (PI; 10 µg/ml). In another analysis, ConA and ConBr conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) were incubated for 1h (RT) with the acinar cells. To evaluate the effect of ConA and ConBr effect on mitochondrial membrane potential (ΔѰm) of pancreatic acinar cells under administration of SATC, ethanol or APO, the cells were stained with Hoechst 33342, and tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM, fluorescent dye that is readily sequestered by active mitochondria). All analyzes were performed using confocal microscope FluoViewTM 1000 - Olympus. The results showed that the SATC, ethanol and APO groups caused significant necrosis on cells compared to control groups, and pretreatment ConBr and ConA caused a significant protection against harmful necrosis caused by all three agents. When lectins were complexed to their α-MM ligand sugar, this protective effect was significantly reversed; not being changed, however, by no specific sugar D-galactose, suggesting a participation of the lectin domain in protective effect. Lectins conjugated with FITC showed a marking on acinar cells at the level of membrane, confirming its interaction with carbohydrates present on the surface of these cells. In the analysis of mitochondrial potential, SATC, ethanol and mainly APO triggered intense depolarization of ΔѰm of pancreatic acinar cells. Pretreatment with ConA prevented mitochondrial dysfunction in all injury models, however ConBr prevented this injury caused by a dysfunction in SATC and ethanol, without changing the dysfunction caused by APO. Given the above, Con A and Con Br protect pancreatic acinar cells against necrosis induced by sulfated taurolithocholic acid, ethanol and APO with its effects mediated by lectin domain, beyond of the maintenance the integrity of the mitochondrial membrane of pancreatic cell, determinant factor to prevent the course of necrosis in acute pancreatitis.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/11270
metadata.dc.type: Dissertação
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