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Title in Portuguese: Recuperação e purificação de β-galactosidase de Kluyveromyces lactis utilizando cromatografia de modo misto
Title: Recovery and purification of a Kluyveromyces lactis β-galactosidase by Mixed Mode Chromatography
Author: Lima, Micael de Andrade
Advisor(s): Silva Júnior, Ivanildo José da
Keywords: Engenharia química
Enzimas
Fermentação
Issue Date: 19-Feb-2014
Citation: LIMA, M. A. Recuperação e purificação de β-galactosidase de Kluyveromyces lactis utilizando cromatografia de modo misto. 2014. 98 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química)-Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014.
Abstract in Portuguese: As mais importantes lactases, em termos de interesse biotecnológico, são aquelas produzidas por leveduras do gênero Kluyveromyces, que são intracelulares e, em sua maioria, são obtidas por fermentação em cultura submersa. Esta técnica, assim como a maioria dos processos biotecnológicos, envolve a necessidade de purificação de proteínas e peptídeos a partir de uma variedade de fontes. Neste contexto, uma das técnicas mais notavelmente promissoras é a cromatografia de modo misto, que permite interações iônicas e hidrofóbicas simultaneamente entre o adsorvente e o adsorbato. O objetivo do presente trabalho foi estudar a viabilidade da recuperação e purificação da enzima β-galactosidase, produzida por meio de processo fermentativo e utilizando o micro-organismo Kluyveromyces lactis, por técnica de cromatografia de modo misto. Operações unitárias de precipitação proteica e diálise foram também realizadas com o intuito de concentrar a enzima de interesse e eliminar detritos celulares e outros interferentes advindos do meio de fermentação, o que ocasionaria uma diminuição do rendimento do processo. A produção se apresentou satisfatória, com uma média de valores de concentração de enzimas totais de 0,45 mg/mL, atividade enzimática de 67 U/mL, atividade específica de 167,9 U/mg. O Fator de Purificação obtido foi de 1,17. Uma precipitação seguida de diálise foi realizada e a posterior corrida cromatográfica em leito fixo com esse material rendeu valores de recuperação de 41,0 e 48,2% de proteína total e atividade total, respectivamente. A análise de eletroforese SDS-PAGE confirmou a evolução do processo de purificação no decorrer das operações unitárias, atestando a viabilidade do emprego das técnicas utilizadas para obtenção de enzimas com considerável grau de pureza com alto valor comercial agregado.
Abstract: The most important lactases, as far as biotechnological interest is concerned, are those produced by Kluyveromyces yeasts, which are intracellular and currently obtained mostly by submerged-state fermentation. This technique, just as the mainstream biotechnological processes, involves a need for protein and peptide purification from a variety of sources. In this context, one of the most promising notable techniques that can be highlighted is Mixed Mode Chromatography, which allows simultaneous ionic and hydrophobic interactions between the adsorbent and the adsorbate. Thus, the aim of this work was to assess the feasibility of recovery and purification of a Kluyveromyces lactis β-galactosidase, produced via fermentation process, by employing Mixed Mode Chromatography. Unit operations, such as protein precipitation and dialysis were also performed in order to concentrate the enzyme of interest and eliminate cell debris and other interferences inherent in the fermentation medium, something that would result in a decrease in the process yield. The production showed satisfactory results, with mean values for total enzyme concentration of 0.45 mg/mL, enzymatic activity of 77 U/mL and specific activity of 167,9 U/mg. The Purification Factor obtained was 1.17. A precipitation step, followed by a dialysis process, was performed and the later chromatographic run carried out in fixed bed with this material yielded recovery values of 41.0 and 48.2% of total protein and activity, respectively. SDS-PAGE Electrophoresis confirmed the purification evolution throughout the unit operations employed, confirming the viability of the employment of the techniques used to obtain an enzyme of considerable degree of purity and possessing high-added value.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/10781
metadata.dc.type: Dissertação
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