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Title in Portuguese: Efeito da privação da glutamina sobre as células secretoras do epitélio intestinal em um modelo in vitro de enteroide
Title: Effect of deprivation of glutamine on secretory cells of the intestinal epithelium in an in vitro model of enteroide
Author: Costa, Tie Bezerra
Advisor(s): Oriá, Reinaldo Barreto
Keywords: Glutamina
Celulas de Paneth
Mucosa Intestinal
Issue Date: 2012
Citation: COSTA, Tie Bezerra. Efeito da privação da glutamina sobre as células secretoras do epitélio intestinal em um modelo in vitro de enteroide. 2014. 73 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014.
Abstract in Portuguese: O epitélio intestinal é formado e mantido por uma população de células-tronco capaz de gerar diferentes linhagens celulares, mantendo a pluripotência e a capacidade de auto-renovação. A glutamina é um aminoácido essencial condicional importante para a manutenção do epitélio do intestino. No entanto, poucos estudos têm explorado o papel da glutamina na regulação fina do turnover celular da cripta intestinal. Com o propósito de avaliar o papel da glutamina n o turnover de células da cripta, foi utilizado um modelo in vitro de enteroide, onde as células-tronco são capazes de gerar um epitélio contendo as principais linhagens de células secretoras intestinais (célula de Paneth, célula caliciforme e célula enteroendócrina), além dos enterócitos absortivos, com a formação de uma estrutura tipo vilosidade-cripta. Este modelo foi usado para testar o efeito de 24 horas de privação de glutamina (meio padrão com glutamina a 2 mM vs meio livre de glutamina) no turnover epitelial através da contagem de células marcadas por Edu/número total por secção e ainda na apoptose celular, através da contagem de células marcadas para caspase 3-clivada/número total por secção. A fim de avaliar a função secretora das criptas, as razões das células de Paneth e caliciformes por cripta (célula alvo/número total de células secretoras por cripta) foram medidas. O número de células de Paneth e caliciformes foi obtido com o auxílio da microscopia confocal e imunomarcação para lisozima e mucina-2. Além disso, os transcritos dos produtos das células de Paneth e caliciformes (lisozima e mucina, respectivamente) foram analisados utilizando o método de PCR quantitativo em tempo real. Com intuito de avaliar o potencial papel imunomodulador da glutamina, transcritos de elementos da imunidade inata, receptor de tipo Toll e sua proteína acessória MD-2, e citocinas, a saber: TNF-α, IL-1β e CXCL-1, foram medidos. A privação de glutamina reduziu o número de células Edu positivas, em comparação com o enteroide sob meio padrão (p=0,006). Não houve diferença significativa em relação às razões das células de Paneth e células caliciformes entre os grupos após privação de glutamina. A privação da glutamina diminuiu significativamente os transcritos de lisozima, em comparação com o enteroide sob meio padrão (p = 0,007), mas não para mucina-2, transcrição relacionada com a função das células caliciformes. Uma transcrição reduzida para TNF- α e MD-2 (p=0,005 e p=0,016, respectivamente) foi observada após a privação de glutamina. Ao todo, nossos achados reforçam o papel positivo da glutamina sobre o turnover do epitélio intestinal e, além disso, sugerem um importante efeito regulador da glutamina sobre as células de Paneth e resposta imune inata. O modelo enteroide fornece uma ferramenta importante para dissecar os mecanismos de proteção pela glutamina e guiar estudos futuros.
Abstract: The intestinal epithelium is formed and sustained by a population of stem cells capable of generating different cell lines while maintaining pluripotent and self-renewal capacity. Glutamine is a conditional essential amino acid important for the maintenance of the intestinal epithelium. However, few studies to date have explored the role of glutamine in the fine regulation of the intestinal crypt cell turnover. In order to evaluate the role of glutamine in the crypt cell turnover, an in vitro enteroid model was used, where stem cells are capable of generating an epithelium containing the main intestinal secretory cell lines (Paneth, goblet, and enteroendocrine cells) and absorptive enterocytes as well, while forming a villus-crypt like structure. This model was used to test the effect of 24h of glutamine deprivation (standard media with 2mM glutamine vs glutamine-free media) on epithelial turnover by counting EdU- labeled cells/total number per section and cell apoptosis by counting cleavage-caspase 3- labeled cells/total number per section. In order to assess crypt secretory function, Paneth and goblet crypt cell ratios (target secretory cell/total cell number per crypt) were measured. The number of Paneth and goblet cells was measured with the aid of confocal microscopy and lysozyme and mucin-2 immunostainning. In addition, Paneth and globet cell product transcripts (lysozyme and mucin, respectively) were measured using quantitative Real-time PCR. In order to assess the potential immunomodulatory role of glutamine, innate immune element transcripts, Toll like receptor and their accessory protein MD-2, and cytokines, as follows: TNF-α, IL-1β and CXCL-1, were measured. Glutamine deprivation reduced the number of EdU positive cell ratio as compared with the enteroid under the standard media (p=0.006). No significant differences regarding Paneth and goblet cell ratios were seen between groups following glutamine deprivation. Glutamine deprivation significantly decreased lysozyme transcripts as compared with the enteroid under the standard media (p=0.007), but not for mucin-2 transcripts, related to goblet cell function. Decreased TNF-α and MD-2 transcription (p=0.005 and p=0.016, respectively) were found following glutamine deprivation. Altogether, our findings reinforce the glutamine positive role on the intestinal epithelial turnover and furthermore suggest an important glutamine regulatory effect over Paneth cells and the innate immune system. The enteroid model provides an important tool the dissect the mechanisms of glutamine protection and shed light for future studies.
URI: http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/10626
metadata.dc.type: Dissertação
Appears in Collections:DMC - Dissertações defendidas na UFC

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